浒苔附生菌的初步研究

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1、上海海洋大学硕士学位论文学校代码：10264研究生学号：M150111225上海海洋大学硕士学位论文题目：浒苔附生菌的初步研究Preliminarystudyonepiphyticbacteria英文题目：OfUlvaprolifera专业：海洋科学研究方向：海藻分子生物学姓名：陈冉指导教师：何培民蔡春尔二O一八年六月四日1上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或

2、集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期

3、：年月日2上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注施定基中科院植物所教授主席孙涛上海交通大学教授委员王全喜上海师范大学教授委员贾睿上海海洋大学副教授秘书答辩地点上海海洋国家大学科技园答辩日期2018.5.293上海海洋大学硕士学位论文浒苔附生菌的初步研究摘要附生细菌在藻类生活史中对营养吸收、形态结构的形成起着关键作用。因为海洋细菌中只有1%的可以培养，而大量为未知的细菌，相对于附生菌，内生菌的相关研究性报道较少。一些大型海藻已经有明确存在的内生菌[1-2]，且因为细菌生存于藻体内部，所以它的随着环境的变

4、化程度不大。Aires等人通过分子生物学技术中的高通量测序对蕨藻（C.taxifolia）内生菌群落结构进行了分析，发现无论外界环境发生什么样的刺激，内生菌群落结构依然保持稳定状态[3-4]。这些研究结果都表明藻类的附生菌会因为地域、时间以及生存条件的不同而改变，而内生菌组成更加稳定和特异，对藻类生长起到了非常关键的作用，这提示需要对内生菌与附生菌展开区别研究[4]。现在我们可以使用菌群多样性分析的手段清楚的知道藻类内外共生的细菌种类及数量。对绿潮藻的浒苔属浒苔种藻体样品的内外共生菌分别进行组成分析，菌群多样性分析直观的展示出浒苔的共附生菌中都存在

5、一些与现有数据库中序列的遗传关系较远的菌株。分析发现浒苔内外共生菌中交替单胞菌占据优势，其次是chloroplast-norank和polaribacter4。更加表明，需要区别研究海藻的胞内外细菌种类，并且浒苔周遭共生的细菌是他们在生存环境中互相选择的结果。本文分离鉴定获得了可培养的CFB菌株，利用抗生素法建立了浒苔无菌发育实验体系，将用于菌株的MG（形态发生）功能验证。分离纯化培养得到可培养的浒苔胞外共生菌，用16SrDNA基因序列比对的方法鉴定了共生菌的种类分别是红杆菌属（Rhodobacteraceae）、海杆菌属（Marinobacter

6、）、Marivita和Rosevirus，他们都曾是有文献报道的可能是对浒苔的形态发生有着重要影响的细菌。为检测浒苔外生菌对浒苔形态发生过程的影响，首先对实验室培养的浒苔进行了外生菌的分离和纯化，再应用抗生素方法对浒苔藻体进行无菌化处理，观察刚刚放散的浒苔的形态发生过程。在扫描电镜下观察到暂时的无菌状态，在无菌条件下浒苔的形态发生变化，变得不规则且生长速度极慢，而随着浒苔藻体的生长，叶片经历了从形态异常到较为正常的过程，并且无菌的死亡的藻体不会被降解。因此推测浒苔在生活史中出现的各种生存的形态变化可能与附生菌有关。与此同时，得知与绿藻共生的一种黄杆

7、菌属（Flavobacteria）可以分泌胞外酶，该酶可以降解绿藻细胞壁中的多糖从而得到功能寡糖，也因此发现该细菌是一个新的种属[5]，之前未有报道过。基于对酶法制备寡糖的各种优势，我们想通过基因工程和蛋白质工程的手段，人工合成胞外共生菌产生的酶蛋白的核酸序列，通过原核表达的方法将其异源表达出来，并比较不同原核表达载体和受体重组转化表达石莼多糖裂解酶基因的效果。将人工合成的石莼多糖裂解酶基因片段分别酶切接入原核表达载体pColdⅠ质粒和pET-28a(+)质粒，得到重组质粒pColdⅠ-859和pET-28a（+）-859（859代表石莼多糖裂解酶

8、基因），经双酶切测序鉴定后，分别4上海海洋大学硕士学位论文将质粒pColdⅠ-859转入大肠杆菌RP（DE3）感受态细胞，