荧光蛋白标记检测细胞自噬的方法改进

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1、万方数据中图分类号：UDC：学校代码：密级：尚嗣大謦硕士学位论文10055公开荧光蛋白标记检测细胞自噬的方法改进AmoreeffectivewaytotrackAtgproteins论文作者奎墨指导教师遨圭垩副麴援申请学位理堂亟±培养单位医堂瞳学科专业生理堂研究方向细照自堕筮王调控扭剑答辩委员会主席扬皇评阅人汪注王邀南开大学研究生院二O一四年五月万方数据南开大学学位论文使用授权书根据《南开大学关于研究生学位论文收藏和利用管理办法》，我校的博士、硕士学位获得者均须向南开大学提交本人的学位论文纸质本及相应电子版。本人完全了解南开大学有关研究生学位论文收藏和利用的管理规定。

2、南开大学拥有在《著作权法》规定范围内的学位论文使用权，即：(1)学位获得者必须按规定提交学位论文(包括纸质印刷本及电子版)，学校可以采用影印、缩印或其他复制手段保存研究生学位论文，并编入《南开大学博硕士学位论文全文数据库》；(2)为教学和科研目的，学校可以将公开的学位论文作为资料在图书馆等场所提供校内师生阅读，在校园网上提供论文目录检索、文摘以及论文全文浏览、下载等免费信息服务；(3)根据教育部有关规定，南开大学向教育部指定单位提交公开的学位论文；(4)学位论文作者授权学校向中国科技信息研究所及其万方数据电子出版社和中国学术期刊(光盘)电子出版社提交规定范围的学位论文

3、及其电子版并收入相应学位论文数据库，通过其相关网站对外进行信息服务。同时本人保留在其他媒体发表论文的权利。非公开学位论文，保密期限内不向外提交和提供服务，解密后提交和服务同公开论文。论文电子版提交至校图书馆网站：http：／／202．113．20．161：8001／index．htm。本人承诺：本人的学位论文是在南开大学学习期间创作完成的作品，并已通过论文答辩；提交的学位论文电子版与纸质本论文的内容一致，如因不同造成不良后果由本人自负。本人同意遵守上述规定。本授权书签署一式两份，由研究生院和图书馆留存。作者暨授权人签字：南开大学研究生学位论文作者信息20年月日论文题目

4、荧光蛋白标记检测细胞自噬的方法改进姓名李丹学号2120111087答辩日期2013年5月19日论文类别博士口学历硕士■硕士专业学位口高校教师口同等学力硕士口院／系／所医学院专业生理学联系电话18622389775Emaildanli0827@163．corn通信地址(邮编)：天津市南开区卫津路94号南开大学医学院(300071)备注：是否批准为非公开论文否注：本授权书适用我校授子的所有博士、硕士的学位论文。由作者填写(一式两份)签字后交校图书馆，非公开学位论文须附《南开大学研究生申请非公开学位论文审批表》。万方数据南开大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论

5、文，是本人在导师指导下进行研究工作所取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任由本人承担。学位论文作者签名：非公开学位论文标注说明年月日(本页表中填写内容须打印)根据南开大学有关规定，非公开学位论文须经指导教师同意、作者本人申请和相关部门批准方能标注。未经批准的均为公开学位论文，公开学位论文本说明为空白。论文题目申请密级口限制(≤2年)口秘密(≤10年)口机密(≤20年)保密期限2

6、0年月日至20年月日审批表编号批准日期20年月日南开大学学位评定委员会办公室盖章(有效)注：限制★2年(可少于2年)：秘密★10年(可少于10年)：机密★20年(可少于20年)万方数据摘要在酵母细胞自噬研究中，最常用的检测细胞自噬的方法之一是用荧光蛋白标记自噬相关蛋白。在我们的实验研究中，会经常用到带有荧光蛋白标签的融合蛋白。具体构建方法是在PCR引物中加上45bp左右的目的基因同源片段，然后用扩增的PCR片段转化酵母，通过酵母细胞的同源重组在目的蛋白的C端连接上荧光蛋白。在大量的实验研究中，我们发现这种构建融合蛋白的方法是相当低效的。酵母细胞中基因同源重组的正确率，

7、在很大程度上取决于两个基因同源片段的长度。由于PCR引物长度的限制，这个加在PCR引物上的同源片段的长度也是有限的，另外PCR过程中也会存在一定概率的突变。为了提高我们的实验效率同时降低试验误差，我们构建了两组质粒，用于快速的构建自噬相关蛋白和GFP的融合蛋白。这些质粒的构建原则仍然是利用酵母基因同源重组，但是扩大了同源片段的长度，这样融合蛋白菌株的构建正确率从原来的10％左右提高到了现在的80％以上。并且构建过程中不再需要PCR，这两组质粒在很大程度上提高了我们的实验效率和实验的重复性。细胞自噬被诱导之后，At98通过与脂类分子PE结合，锚定在自噬