自噬荧光标记探针介绍-20151030

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1、眼见为实-自噬荧光标记探针介绍李琳子，博士技术应用专家LifeSciencesSolutions赛默飞世尔科技Theworldleaderinservingscience细胞大扫除-自噬作用（Autophagy）研究热点-疾病相关自噬研究大幅增加！Figurefrom:Klionsky(2007)NatureReviewsMolecularCellbiology8931-9372内容•自噬概述•自噬检测手段•荧光成像挑战及疑难解答•资源3两种降解途径-蛋白质泛素(短寿命)UPS（泛素-蛋白酶体途径）E1-E3连接酶P62HPGmTORE1-E3样连接酶APAPLAPL(自噬-溶酶体途径)-蛋白

2、质(长寿命)LC3B-II-细胞器-病原体溶酶体LC3BmTOR4自噬作用什么是自噬作用-Autophage？源自希腊语auto“自己”和phagy“吃”它的功能是什么？•细胞稳态•发育•细胞死亡•质量控制•应对侵入5自噬作用的三种主要类型微自噬巨自噬微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associatedprotein1lightchain3,LC3)分子伴侣介导的自噬Biosensors–EmergingMaterialsandApplications2011年7月6巨自噬阶段1.自噬起始阶段2.LC3募集3.P62结合4.自噬体形成5.自噬性溶酶体融合6.LC3B解离7.内容物

3、降解7自噬检测方法ToolsTechniques利用LC3B&p62示踪自噬过程利用LC3B示踪自噬过程抗体监测自噬体成熟利用p62示踪选择性自噬溶酶体标记物定位和示踪溶酶体荧光蛋白定位和示踪溶酶体内容物蛋白质合成及降解染料8实验中需考虑的因素：低自噬体荧光强度高自噬体荧光强度观察到自噬体标记信号升高。两个可能原因：•自噬诱导？•自噬流抑制？9自噬作用的刺激和抑制处理观察的结果10自噬作用的刺激和抑制处理观察的结果抑制自噬流在存在溶酶体抑制的情况下，未观察到自噬体标记信号升高存在溶酶体抑制剂11自噬作用的刺激和抑制处理观察的结果在存在溶酶体抑制的情况刺激自噬流下，自噬体标记信号升高存在溶酶体抑

4、制剂12自噬作用的刺激和抑制•自噬激活：•自噬流抑制：•饥饿诱导：Earle’s缓冲液（EBSS）•氯喹：工作浓度：30-100uM孵育时间：12-16小时•其他抑制剂：3-MA、沃曼青霉素、氨水等•雷帕霉素类似物，如PP242(Tocris)工作浓度：1-20uM孵育时间：2小时NickJ.Dolman,et.al.CurrentProtocolsinCytometry,201313Proprietary&ConfidentialLC3B检测•LC3B参与自噬体形成及闭合PELC3LC3ILC3IILC3ILC3IIAtg4Atg3Atg714利用LC3B抗体检测自噬作用抗体可通过下列方法检

5、测LC3B的内源性表达水平：•蛋白质印迹•成像•微孔板分析最小剂量的氯喹最大剂量的氯喹AlexaFluor®594二抗标记的抗LC3B15利用LC3B荧光融合蛋白检测自噬作用Premo™AutophagySensorLC3B是LC3B和GFP或RFP的融合蛋白：•活细胞自噬指示剂•LC3B突变型用作对照重组体诱导对照甘氨酸120丙氨酸120PELC3B野生型LC3B突变型16利用LC3B定量自噬通过检测LC3B水平并进行自动图像分析的方法有两种：1.斑点计数2.核周区域的强度染色染色强度自噬体数量自噬激活剂/抑制剂自噬激活剂/抑制剂17文献例子YRagazzoni,et.al.Thethiaz

6、olederivativeCPTH6impairsautophagy,CellDeathandDisease,2013JenniferMartineza,,et.al.Microtubule-associatedprotein1lightchain3alpha(LC3)-associatedphagocytosisisrequiredfortheefficientclearanceofdeadcells,PNAS,201118活细胞中的自噬成像延时利用Premo™AutophagySensorLC3BRFP进行活细胞成像，实现自噬作用的延时监测。延时成像显示了自噬体形成的时程和位置每2分钟采集

7、一次图像。19活细胞中的自噬多重分析Mitotracker(红色）GFP-LC3B（绿色）RongbinZhou,et.al.AroleformitochondriainNLRP3inflammasomeactivation,Nature,201120自噬体成熟示踪pH4pH7pH421自噬体成熟示踪Premo™AutophagyTandemSensor可以示踪pH值的变化，监测自噬体成熟。pKa