阴沟肠杆菌中若干β--内酰胺类耐药基因的筛选及功能研究

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1、万方数据温州医科大学硕士学位论文论文题目：阴沟肠杆菌中若干13．内酰胺类耐药基因的筛选及功能研究答辩委员会主席：严杰教授答辩委员会成员：张丽芳教授胡云良教授论文答辩日期：2016年5月1713万方数据温州医科大学硕士学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．91．前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．材料与

2、方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1．1实验菌株⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一122．1．2主要实验试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯122．1．3主要实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．1．4主要生物信息学工具⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．142．1．5pET-28a(+)表达载体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．152．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．2

3、．1SDS法提取阴沟肠杆菌基因组⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．162．2．2阴沟肠杆菌混合基因组的测序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．162．2．3D一内酰胺类耐药基因序列的收集⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．2．4D一内酰胺类耐药基因序列与阴沟肠杆菌混合基因组序列的比对⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．2．5细菌基因组DNA提取试剂盒提取阴沟肠杆菌基因组．．202．2．6选择研究基因并设计引物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．202．2．7PCR筛选耐药基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．23(1)PCR反应体系⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23(2)PCR反应条件⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．23(3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．24(4)PCR产物测序及测序序列比对鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯242．2．8耐药基因的克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24(1)PCR扩增获得目的基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24(2)PCR产物纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24(3)pET-28a质粒的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25(4)PCR产物及pET-28a质粒双酶切⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26(5)酶切后PC

5、R产物及pET-28a质粒产物纯化⋯⋯⋯⋯26(6)PCR产物与pET-28a载体的连接⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26(7)BL21感受态细胞的制备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．27(8)重组质粒的转化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一27万方数据温州医科大学硕士学位论文2．2．9重组质粒的鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27(1)重组转化子PCR鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27(2)重组质粒的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一27(3)重组质粒双酶切鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28(4)重组质粒测序鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

6、⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．2．10荮物敏感试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28(1)实验准备：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．29(2)抗菌药物的配制：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29(3)抗茵药物平板的制备：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29(4)菌液的准备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．30(5)接种细菌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．30(6)读取结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．302．2．11接合转移实验进行耐药基因的基因定位⋯⋯⋯⋯⋯30(1)质粒接合转移试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

7、⋯⋯⋯⋯⋯⋯30(2)接合转移实验验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．1D一内酰类胺耐药基因的收集结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．323．2阴沟肠杆菌混合菌株S01exa测序结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯343．3p一内酰类胺耐药基因序列在阴沟肠杆菌中的分布情况⋯．．353．4PCR筛选结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯363．5耐药基因的测序及分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯373．6重组表达质粒双酶切鉴定结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

8、⋯373．7重组表达质粒测序结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一383．8琼脂稀释法测定MIC结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．9接合转移实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．404．分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．424．1高通量测序及生物信息学技术在耐药基因研究中的应用⋯424．2MIC药敏结果分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯434．3接合转移实验进行耐药