电针干预对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡的影响及其机制研究

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1、Y12t．3-343分类号：泰山厘学院硕士研究生学位论文论文题目：电针干预对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡的影晌及其机制研究系(医院、所)：泰山医学院基础部研究生姓名：陈小娱学科、专业：神经生物学研究方向：缺血性脑损伤指导教师：白波教授张秋玲副教授入学时间：2004年9月论文工作起止时间：2005年9月～2007年4月缩略词表6原创性声明本人郑重声明：所呈交韵学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要

2、贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。论文作者签名：孑氧此日期：]壹釜≯址关于学位论文使用授权的声明本人完全了解泰山医学院有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权泰山医学院可以将本学位论文的全部或部分内＼容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文和汇编本学位论文。(保密论文在解密后应遵守此规定)论文作者签名：陋师签名：缸期：。云zL电针干预对大鼠脑缺血再灌注后神经元凋亡

3、的影响及其机制研究研究生：导师：专业：陈小娱白波教授张秋玲副教授神经生物学摘要目的观察电针对大鼠急性局灶性脑缺血再灌注后神经元凋亡和caspase．3表达的影响，探讨线粒体介导的凋亡通路在缺血性脑损伤中的作用及电针干预作用的可能机制，为电针治疗缺血性脑血管病提供实验依据。方法1．动物模型的制备：采用大脑中动脉栓塞法(MCAO)制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型。雄性SD大鼠，水合氯醛腹腔麻醉，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)。结扎剪断ECA，用肝素处理过的尼龙栓子沿剪口从颈外动脉残端插入，

4、经CCA进入ICA，以CCA分叉处计算进线深度为18．0±0．5伽，至大脑中动脉起始部，造成局灶性脑缺血状态，缺血30min后缓慢拔出尼龙栓子再灌注24h。2．电针方法：大鼠穴位定位参考《实验动物穴位图谱》。电针治疗组大鼠选取“水沟”和“百会”穴，应用韩氏穴位神经刺激仪，频率2～15Hz，间断疏密波，电流强度1mA，以肌肉轻微震颤为度，持续时间30min。3．线粒体膜电位及凋亡发生率的测定：雄性SD大鼠，随机分为假手术实验对照组(sham)，脑缺血再灌注组(I，It)和脑缺血再灌注+针刺组(I／R+EA)。脑缺血再灌注

5、24h后取脑组织制各单细胞悬液，用罗丹明123(Rhodamine123)和AnnexinV．FITC进行荧光染色，通过流式细胞仪检测细胞内荧光强度，分析脑组织细胞线粒体膜电位及凋亡发生率的变化。4．Caspase-3蛋白免疫荧光组织化学检测：雄性SD大鼠，随机分为sham组、I瓜和FR+EA组。用共聚焦激光扫描显微镜对免疫荧光双标的缺血脑片进行双通道断层扫描，观察脑缺血再灌注24h后大鼠大脑皮层caspase．3蛋白阳性细胞荧光强度，的变化。5．Caspase．3mRNART-PCR扩增：雄性SD大鼠，随机分为sha

6、m组、lfR和FR+EA组。应用逆转录．聚合酶链反应(RT_PCR)，观察脑缺血再灌注24h大鼠大脑皮层easpase一3mRNA表达的变化。结果1．FR组脑组织细胞线粒体膜电位较sham组明显下降(P<0．01)；EA组线粒体膜电位显著升高，与I瓜组相比有显著性差异(JP(0．01)，但较sham组线粒体膜电位仍明显降低(P<0．01)，结果有统计学意义。2．I／R组脑组织细胞凋亡率较sham组明显增高(P<0．01)；EA组细胞凋亡率显著降低，与I／R组相比有显著性差异(P<0．01)。3．共聚焦激光扫描显微镜观察

7、发现，easpase．3蛋白阳性细胞显示为绿色荧光，主要在神经元胞浆内表达，细胞核少量表达。I／R组caspase．3蛋白阳性细胞平均荧光强度与sham组比较显著升高(P<0．01)；EA组caspase．3蛋白阳性细胞平均荧光强度明显下降，较I／R组有显著性差异(尸<0．01)，但较sham组平均荧光强度仍明显升高，结果有统计学意义。4．I瓜组大脑皮层caspase．3mRNA表达与sham组相比明显升高(P

8、am组仍明显升高(P<0．01)，结果有统计学意义。．结论1．急性局灶性脑缺血再灌注后大鼠大脑皮层区脑组织细胞线粒体膜电位下降、凋亡发生率升高、easpase-3mRNA及蛋白表达均明显升高。2．电针治疗降低中风致残率和死亡率的机理可能和其改善脑组织细胞线粒体膜电位水平、降低凋亡发生率、下调easpase．3mRNA及蛋白表达有关