京尼平苷调节ins-1细胞胰岛素分泌分子机制的研究

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1、中文摘要摘要2型糖尿病(Type2diabetesmellitus，T2DM)是一种常见的代谢性疾病，其主要特点是胰岛素抵抗和胰腺B细胞功能下降或数量减少导致的胰岛素分泌相对不足。近年来，基于肠促胰素(Incretin)的治疗是2型糖尿病治疗领域的研究热点，其中的代表就是肠道L细胞分泌的胰高血糖素样肽．1(Glucagon—likepeptide．1，GLP．1)。GLP．1通过激活其受体来促进胰岛素分泌、提高胰岛素合成、刺激胰岛B细胞增殖、阻止其凋亡。但是内源性的GLP一1在体内很快被二肽基肽酶．IV(Dipep

2、tidylpeptidaseIV,DPP．iv)降解，其半衰期非常短，只有l～2分钟，皮下注射后，只有10％生物活性的GLP．1到达血浆，极大的限制了其临床应用。因此，筛选并研究GLP．1受体小分子激动剂对于治疗2型糖尿病具有十分重要的意义。在前期工作中，我们发现传统中药栀子的主要活性成分——京尼平苷(Geniposide)是一种新型的GLP一1受体的激动剂，它可通过激活GLP．1受体表现出神经营养和神经保护作用；尤其重要的是，在链尿佐菌素(Streptozotocin，STZ)诱导的2型糖尿病大鼠模型上研究发现，

3、京尼平苷具有降低血糖水平、调节胰岛素分泌、改善糖尿病大鼠的胰岛素抵抗的作用。这些结果都提示，京尼平苷可能是一个治疗2型糖尿病的先导化合物。但是，对于京尼平苷如何调节胰岛素分泌及其作用机制还不清楚。本研究将前期研究基础上，探讨京尼平苷对胰腺p细胞系INS．1细胞胰岛素分泌的影响，探索GLP．1受体与京尼平苷调节胰岛素水平的相关性及其细胞信号转导途径，为京尼平苷的临床应用提供实验依据。利用ELISA方法，本文首先考察了京尼平苷对INS．1细胞胰岛素分泌的影响，结果发现，京尼平苷可直接诱导INS一1细胞分泌胰岛素，而且在

4、中低浓度(5．5、11、16．7raM)的葡萄糖存在条件下，京尼平苷可明显促进B细胞对葡萄糖的吸收、利用和ATP产生，增强葡萄糖诱导的胰岛素分泌。其次，本文还分析了GLP．1受体与京尼平苷调节胰岛素水平的相关性。实验结果证实，在预先用GLP．1受体拮抗剂exendin(9-39)孵育细胞后，京尼平苷对INS．1细胞中葡萄糖诱导的胰岛素分泌的调节作用被明显抑制；与此同时，我们还利用分子生物学技术，设计并构建了GLP．1受体基因的siRNA干扰质粒，并对干扰效率进行了分析、比较，建立了GLP．1R干扰的INS．1细胞株

5、。结果发现，在GLP．IR干扰的INS．1细胞中，京尼平苷对葡萄糖诱导的胰岛素分泌的调节作用也被明显抑制。上述实验结果表明，GLP一1受体在京尼平苷调节胰岛13细胞的胰岛素分泌的过程中有重要作用。然后，利用激酶抑制剂阻断的方法，对京尼平苷调节胰岛素分泌的细胞信号重庆大学博士学位论文转导机制进行了初步研究。实验结果发现，预先用P13K激酶抑制剂LY294002和EGFR阻断剂AGl478孵育INS．1细胞30分钟，可明显抑制京尼平苷对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的调节作用，表明京尼平苷调节胰岛素分泌可能与这些激酶途径有关。

6、Westernblot实验结果也表明，京尼平苷可调节INS．1细胞中P13K信号通路中PDKl、PKB／Akt磷酸化水平，P13K抑制剂LY294002能明显抑制京尼平苷诱导的INS一1细胞中PDKl和Akt磷酸化，证明京尼平苷调节葡萄糖诱导的13细胞胰岛素分泌可能与其调节P13K信号通路中关键蛋白PDKI、PKB／Akt的磷酸化有关。本文还在此基础上考察了京尼平苷对P13K信号通路下游与胰岛素分泌密切相关的效应分子的影响。实验证实，京尼平苷能够增强Fox01磷酸化，促进磷酸化的Fox01从核内排出，进而调节下游相

7、关基因的表达。进一步研究发现，P13K抑制剂和EGFR阻断剂都能明显阻断京尼平苷对Fox01磷酸化。相反的，京尼平苷却明显抑制GSK313磷酸化，而且P13K抑制剂能明显阻断京尼平苷的这种抑制作用。提示Fox01和GSK313都有可能参与了京尼平苷对葡萄糖诱导的INS．1细胞胰岛素分泌的调节作用，并且经由了P13K和EGFR信号通路。最后，在对转录调控因子PDX。1的研究中，我们发现，京尼平苷促进PDXl从细胞浆向细胞核转运，促使下游的GLUT2蛋白表达增加。而且这种作用能被P13K激酶抑制剂LY294002和EG

8、FR阻断剂AGl478抑制。提示，京尼平苷可能通过P13K信号通路调节转录因子PDX．1细胞内的转运，促使下游与胰岛素分泌相关的蛋白表达增加。本文研究结果表明，京尼平苷通过激活GLP．1受体，能直接或在中低浓度葡萄糖存在的条件下促进胰岛素释放。其细胞信号转导途径为激活GLP．1受体后，间接调节EGFR活性，进一步磷酸化P13K信号途径，进而抑制GSK31]及