可降解多孔型丝素蛋白%2f羟基磷灰石制备及其修复骨缺损实验的研究

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1、苏州大学博士学位论文可降解多孔型丝素蛋白/羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究姓名：王根林申请学位级别：博士专业：骨外科学指导教师：杨惠林20080501可降解多孔犁丝素蚩白／羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究中文摘要第一部分可降解多孑L型丝素蛋白／羟基磷灰石的制备及其在SD大鼠体内降解的实验观察【目的】制备丝素蛋白／羟基磷灰石(silkfibroin／hydroxyapatite，SF／HA)复合人工骨材料，并将该材料植入生物体内降解，以了解SF／HA在动物体内的降解速率及机体对SF／HA的组织学反应，

2、为后续成骨实验提供可靠的参考数据。【方法】以蚕丝丝素蛋白作为羟基磷灰石沉积的模板，以家蚕丝素短纤维为增强材料，以NaCl为致孔剂，采用等静压的方法制备4种SF／HA复合多孔材料。以羟基磷灰石为对照组，测定4种SF／HA复合材料及羟基磷灰石在O．5h、2h、6h、12h及24h不同时间点的吸水率。将4种SF／HA复合材料及羟基磷灰石植入SD大鼠背部皮下，进行体内降解观察。实验组分别于术后2、6、12、16、20及24周取材，对照组分别于术后2、12及24周取材，进行大体观察及组织学检查。【结果】丝素蛋白、HA、添加剂

3、及致：fL齐JJ配比不同，制备的4种SF／HA人工骨材料的孔径、孔隙率及强度等也不同。材料吸水率趋势如下：SF／HA3、SF／HA4>SF／HA2、SF／HAI>HA。HA、SF／HAI及SF／HA2降解十分缓慢或基本不能降解；SF／HA320"--,24周降解完毕；SF／HA412,--．,16周降解完毕；各种材料周围组织未见明显变性坏死等。【结论】SF／HAl平均孔径为6．5岬，最大孔径也只有151．tin，不适合骨组织工程支架材料的要求。SF／HA4虽然孔径、孔隙率满足要求，但力学强度较低，压缩强度只有1．5

4、9MPa，在水中很快散开，也不适合骨组织工程的要求。故在后续的试验中，我们剔除这两种材料，将对SF／HA3及SF／HA2两种材料进行体外细胞相容性研究。【关键词】丝素蛋白／羟基磷灰石；生物降解；体内实验第二部分免骨髓基质细胞的分离培养及其成骨诱导分化的实验研究’【目的】体外分离培养兔骨髓基质细胞(bonemarrowstromalcells，BMSCs)，并向成骨方向诱导培养，为SF／HA相容性提供检测细胞及为SF／HA组织工程化骨提可降解多孔型丝素蛋白／羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究中文摘要供适宜的种子

5、细胞。【方法】抽取新西兰白兔的骨髓5ml，通过密度梯度离心法获取BMSCs，体外贴壁培养、扩增、传代，倒置显微镜下观察原代及各代细胞形态、数量生长情况，描绘生长曲线。第2代细胞用含1x10-89／1地塞米松、10mmol／l13·甘油磷酸钠及50I．tg／!L．抗坏血酸的条件培养液将其定向成骨诱导培养、扩增。采用倒置相差显微镜观察细胞形态变化；采用MTT法测定细胞增殖情况；使用碱性磷酸酶染色及VonKossa钙结节染色等方法，鉴定其成骨性能。【结果】BMSCs在培养皿中贴壁生长、增殖，条件培养液诱导后表现出明显的成

6、骨活性，细胞增殖良好，体外矿化结节VonKossa染色阳性、碱性磷酸酶染色阳性，证实其有成骨潜能。【结论】可以通过体外分离纯化兔BMSCs，在一定条件下能够向成骨方向诱导分化，并能使细胞保持较高的成骨活性，适于作为材料相容性的检测细胞及构建组织工程化骨的种子细胞。【关键词】骨髓基质细胞；细胞培养；成骨细胞；兔第三部分可降解多子L型丝素蛋白／羟基磷灰石复合人工骨材料的细胞相容性研究【目的】以成骨诱导的BMSCs作为检测细胞，与两种丝素蛋白／羟基磷灰石(SF／HA)进行体外复合培养，检测SF／HA的细胞相容性。【方法】

7、将兔BMSCs体外成骨诱导至第3代，接种到预湿的SF／HA2及SF／HA3材料上复合培养，以单纯BMSCs相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及HE染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。以MTT法检测材料对细胞增殖活性的影响，以碱性磷酸酶活性测定评价其成骨能力，以材料浸提液的细胞毒性试验评估材料是否有细胞毒性。【结果】扫描电镜及组织学观察发现，细胞材料复合后，BMSCs在SF／HA2及SF／HA3上能够良好地粘附和增殖。ALP活性测定及MTT法测定OD值均证实，BMSCs细胞活性及成骨性能不受材料影响，

8、与对照组相比，差异无统计学意义(P>O．05)。材料浸提液细胞毒性试验显示，细胞毒性分级均为0～I级，两种SF／HA浸提液对细II可降解多孔型丝素蛋白／羟基磷灰石的制备及其修复骨缺损的实验研究中文摘要胞生长基本无毒性作用。【结论】SF／HA2与SF／HA3对BMSCs的生长和成骨功能无影响，具有良好的细胞相容性，具有构建组织工程化骨的可行性。【关键词】生物相