微生物酶法从苦荞中制备槲皮素的工艺方法的研究

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1、四川农业大学硕士学位论文微生物酶法从苦荞中制备槲皮素的工艺方法的研究姓名：熊宇申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：邵继荣201012摘要微生物发酵是利用微生物生长代谢过程中产生的酶对目标底物进行特殊的酶促反应。其优越性在于反应条件温和、操作简便、成本低、危害少，可进行复杂的化学合成、天然产物转化。苦荞学名鞑靼荞麦(Fagopyrumtataricum)，在四川、云南、贵州、陕西、是山区重要的粮食作物。苦荞植株的茎(秆)，叶、籽粒等器官芦丁含量较高，但通常作为生产废弃物，其经济价值未能充分利用。本试验应用实验室己筛选出的一株具有将芦丁转化为槲皮素的活性

2、青霉菌为材料，探讨了以苦荞为原料，通过微生物发酵制备具有较高纯度槲皮素的工艺方法。希望通过该工艺的构建，为以苦荞为原料制备槲皮素的工业化生产提供理论指导。菌株培养条件研究：首先通过考察菌株生长曲线，培养基中蔗糖、芦丁的含量以及培养温度等因素对菌株生长的影响，然后以培养基中蔗糖、芦丁的含量、培养温度、培养时间的四因素三水平正交试验优化菌株培养条件。研究显示，菌体培养的最优条件为蔗糖259in、培养温度32。C、芦丁29／L、培养时间64小时。发酵条件研究：通过考察菌母液种龄、接种量、培养基pH、无机盐、氮源、碳源等因素，初步研究这些控制因素发酵效果的影响。然后

3、以无机盐(硫酸锌)、料液比、培养温度、额外碳源的四因素三水平正交试验优化发酵的工艺条件。研究表明，最佳发酵条件为无机盐(硫酸锌)0．01％，料液比2．5：1(V／W)，培养温度32℃，额外碳源(蔗糖)209／t,，以7％'--'11％的接种量接种种龄为68h的菌液、pH自然。槲皮素提取条件的研究：通过考察乙醇浓度、浸提时间、固液比等因素对产物回收的影响优化槲皮素的提取条件。研究表明，以75％的乙醇，固液比8：1，加热回流提取2小时能快速有效的回收产物。苦荞发酵制备槲皮素研究：分别选择苦荞植株的叶、茎(秆)、籽粒、壳进行发酵实验，检测底物中芦丁的消耗量以及槲皮

4、素的生产量，研究表明各个器官中芦丁转化为槲皮素的比率分别达到94．3％、91．2％、89．1％、87．3％。经提纯干燥后，所得的槲皮素经HPLC检测，其纯度≥73％，从而证明以苦荞为原料发酵制备槲皮素的工艺方法可行，具有生产应用价值。13-o一糖苷酶的分离纯化及性质研究：试验中从菌株中提取13-o一糖苷酶粗酶液，用葡聚糖凝胶柱色谱(SephadexG．75)和阴离子交换柱色谱(DEAEcellulose．32)进行分离和纯化，通过SDS—PAGE测定p一0一糖苷酶的分子量。结果表明，经纯化后酶的比活性由粗酶液56．3U／mg提高到362．27U／mg，纯化倍

5、数达到了6．43倍，回收率为3．5％。酶的分子量约为68kDa，是一种单体酶。经测定，它的最适反应pH为6．0、最适反应温度为40。C。关键词：微生物发酵制备槲皮素B．0．糖苷酶苦荞IIAbstractMicrobialfermentationisakindofenzymaticcatalyticreactionessentially,whichusingvariouskindsofenzymessecretedbythemicroorganismduringthegrowthofstrain．Ithasadvantagesformildreactionco

6、nditions，simplyoperating，lowcostproducing，lesshazardous，complexchemicalsynthesis，naturalproducttransformation．BuckwheatisakindofimportantfoodcropsinmountainareaofSichuan，Yunnan，GuizhouandShanxiprovinces．Intheorgansofstalks，leaves，seedsandbransofBuckwheat，whichcontainingrutininhighl

7、evel，areusuallyabandonedaswasteofproduction,itseconomicvaluenotbefullyutilizedyet．Inthisexperiment，astrain,whichhastheactivityofhydrolyzingrutintoquercetin，hasbeenuseintofermentationtopreparationquercetinfromBuckwheat．Bythisstudy,I'mtryingtobuildupaprocessasatheoreticalguidancefori

8、ndustrialproductionofquerc