去泛素酶usp5通过smoothend调控hedgehog信号通路参与果蝇眼发育

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1、万方数据答辩委员会主席：答辩委员会成员：万方数据目录11111111111111111111111IIIIIIIIIIIIIIlllllIY2914315摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1Abstract．．．．．．．⋯．．．．．．．⋯．．．⋯．．．⋯．．⋯⋯．．．．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．⋯．．．．．．．．．3前言一黑腹果蝇(Drosophilamelanogast

2、er)作为模式生物⋯⋯⋯⋯⋯．．5第一部分利用RNAi筛选去泛素酶基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一7材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8仪器设备⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8果蝇品系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8化学试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8果蝇的培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9抗体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9果蝇UAS—Gla4

3、双元表达系统⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11果蝇的解剖⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一12果蝇成虫盘的免疫荧光染色和铺片⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．13结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．14一、去泛素酶基因参与果蝇翅膀和眼发育过程⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯14二、去泛素酶基因参与Wingless，Hedgehog／Dpp信号通路⋯⋯．．15三、确定进一步研究的基因

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯16万方数据第二部分USP5通过Hh信号通路调节果蝇眼发育⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．20前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．20日oJ吕⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：：U材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一23主要仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23化学试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23果蝇品系⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24基因组DNA的提取⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25利用P因子不精确剪切获得usp5突变体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25利用FLP—FI汀产生嵌合体克隆⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．28FLPout克隆分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯29l诳hute克隆技术⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．30M-ACI蝴(mosaicanalysiswitharepressiblecellmarker)技术⋯⋯．32抗体⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

6、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．33扫描电镜⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33质粒构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33果蝇S2细胞实验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．39结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42一、果蝇usp5和哺乳动物rAtA．类同源性较高⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42二、usp5在果蝇胚胎和成熟器官中的表达情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43万方数据三、利用P-element方法获得usp5突变果蝇⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4

7、3四、usp5&4苯坝,1试⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．44五、usp5突变体果蝇光感受器发育异常⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45六、．usp5突变可导致眼成虫盘后部Ci累积⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．46七、过表达Hib可以挽救usp5-／一果蝇眼成虫盘后部Ci累积表型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．46八、usp5突变导致SuO％)、Cos2、Fused蛋白水平上调，Smo蛋白水平下调⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47九、u

8、sp5突变影响Hh下游靶基因的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．49十、Smo沉默后对Cos2复合体相关蛋白的影响u秘突变体类似⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．50十一、usp5突变导致细胞内非锚定的多泛素链高度累积⋯⋯⋯．52十二、过表达u矿可以稳定Smo的蛋白水平⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．53十三、USP8和USP5对Smo的稳定性影响的相互作用⋯⋯⋯．53讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯