有机阴离子转运蛋白在马兜铃酸肾病发生中的关键作用

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1、有机阴离子转运蛋白在马兜铃酸肾病发生中的关键作用薛翔，宫丽崑，栾洋，肖瑛，戚新明，李妍，武元峰，邢国振，陈敏，任进*中国科学院上海药物研究所药物安全与评价研究中心上海，201203摘要马兜铃酸（Aristolochicacid,AA）是一大类结构类似的硝基菲羧酸，其主要成分是马兜铃酸I（AAI）。AA是已知的对多种动物种属包括人均肾毒性和致癌性的化合物，特征是引起肾间质纤维化和上尿道癌。有体外实验研究提示肾小管上皮细胞中的有机阴离子转运蛋白（Organicaniontransporter,OAT）可

2、能在AAI被特异性摄取进入肾小管上皮细胞的过程中起作用。然而，在体内复杂环境中，OAT是否确实在AA的特异性摄取及其肾毒性发生中起作用尚缺乏实验依据。本实验研究发现，联合给予小鼠已知OAT抑制剂丙磺舒（Probenecid，PRB）和AAI，可以延缓AAI从血中清除，降低肾脏浓度和升高肝脏浓度，最终减轻AAI所致的肾毒性，同时并无肝毒性的发生。进一步研究发现，AAI在Oat1和Oat3基因敲除小鼠产生的肾毒性均要明显轻于其野生型。以上结果表明，OAT1和OAT3均在特异性跨肾小管上皮细胞转运AAI过

3、程以及AAI肾毒性的发生中起着重要作用，这可能是一个新的潜在的马兜铃酸肾病的防治靶点。关键词：马兜铃酸，有机阴离子转运蛋白，肾毒性*通讯作者1.前言我们以及其他一些研究已经表明错误！未找到引用源。，马兜铃酸（Aristolochicacid,AA）在机体内主要通过两种途径进行代谢和活化，1）由P450介导去甲基氧化反应生成低毒的AAIa，再与葡萄糖醛酸或磺酸结合后排泄；2）由细胞内硝基还原酶如NQO1，XO，CYP1A1和CYP1A2介导的还原反应生成活性中间体氮翁离子，与DNA或蛋白反应引起基因突

4、变或者引发肿瘤。这些活化反应主要发生在肝脏和肾脏，引起肾脏毒性和在啮齿类动物中引起前胃癌。研究者在AA的代谢途径解析中取得了很多进展错误！未找到引用源。，然而AA如何被肾脏细胞摄取，从而导致特异性肾毒性机制尚不清楚。目前仅有体外实验研究表明错误！未找到引用源。，肾小管上皮细胞有机阴离子转运蛋白（Organicaniontransporter,OAT）可能在AAI被摄取进入肾小管上皮细胞的过程中起重要作用。然而，AA在体内的转运机制及OAT是否确实在其肾毒性发生中起作用尚缺乏实验依据。本实验中我们使用

5、已知的OAT抑制剂及基因敲除小鼠等体内实验，证实了OAT在AAI的跨肾小管上皮细胞转运过程以及AAI肾毒性的发生中起着重要作用。2.材料与方法2.1试剂丙磺舒（Probenecid，PRB），AAI均购自Sigma-Aldrich（St.Louis,USA）.2.2动物实验8-10周龄雄性C57BL/6小鼠购自上海实验动物中心(Shanghai,China)。动物分为4组：（1）AAI组小鼠单次经腹腔给予溶于生理盐水中的AAI10mg/kg；以前实验已证实该剂量可在雄性C57BL/6小鼠引起肾毒性；

6、（2）PRB+AAI组小鼠在给予AAI30min前经腹腔给予溶于pH调为7.4的生理盐水中的PRB150mg/kg；该剂量为报道的可以抑制OAT功能的剂量；（3）PRB组小鼠给予生理盐水30min前给予PRB150mg/kg；（4）溶剂对照组：小鼠仅给予两次生理盐水对照。8-10周龄雄性Oat1基因敲除小鼠维持于CharlesRiverLaboratoriesInternational,Inc.(Yokohama,Japan)。8-10周龄雄性Oat3基因敲除小鼠维持于OrientalYeastCo

7、.,Ltd.(Tokyo,Japan)。两种动物各分别设置4组：（1）野生型对照组(WTcontrol)小鼠单次经腹腔给予生理盐水0.2ml/10g；（2）野生型AAI组(WTAAI20)小鼠单次经腹腔给予溶于生理盐水中的AAI20mg/kg；（3）纯合型对照组(KOcontrol)小鼠单次经腹腔给予生理盐水0.2ml/10g；（4）纯合型AAI组(KOAAI20)小鼠单次经腹腔给予溶于生理盐水中的AAI20mg/kg。血清生化和组织病理学检查于给药后第7天进行。肝肾功能指标ALT，AST,BUN和

8、CRE通过HITACHI7080全自动生化分析仪测定。肝脏和肾脏组织固定于10%中性福尔马林液中，石蜡包埋切片。切片经HE染色后于镜下检查病变情况。2.3AAI血清动力学和组织分布小鼠单次腹腔单独给予AAI10mg/kg或联合给予PRB后，经尾静脉于不同时间点（5，10，15，20，30，40，60，90，120min）采血，或于给药30min后采集组织样本。样本按以前方法处理后经HPLC测定其中AAI及其主要代谢产物AAIa的含量。2.4统计学分析所有数据均表述为m