体外无血清分离及培养人角膜上皮干细胞重建眼表的研究

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1、Athesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofDoctorIsolatingandCultivatingHumanCornealEpithelialStemCellswithinvitroSerum—freeSystemtoReconstructOcularSurfaceByZhongzhongXuSupervisor：Prof．LiyaWangandHongminZhangOphthalmologyTheFirstAffiliatedHospitalofZ

2、hengzhouUniversityMarch2013原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：协中中日期：加乃年占脚。日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子

3、版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：忻中申日期：珈B年岁郎D日摘要体外无血清分离及培养人角膜上皮干细胞重建眼表的研究博士研究生许中导师王丽娅教授张红敏副研究员郑州大学第一附属医院捅要背景：角膜上皮细胞的更新来源于角膜上皮干细胞，目前研究显示角膜上皮干细胞主要存在于角膜缘部位，又称角膜缘

4、干细胞。临床上由于严重的化学烧伤、热烧伤、电离辐射、严重炎症、StevensJohnson综合征等，可以导致角膜缘干细胞缺乏或功能障碍，引起视力下降甚至丧失，治疗尤为棘手。随着组织工程技术的飞速发展，体外分离及培养人角膜上皮干细胞，用于角膜缘上皮片的构建，通过临床移植进行眼表重建，成为非常有应用前景的治疗手段。对于角膜上皮干细胞的体外培养，国内外研究学者多采用SHEM(supplementalhormonalepithelialmedium)培养液进行角膜上皮干细胞的培养，但SHEM培养液中含有一定量的胎牛血清，容易促进角膜上皮干细胞的分化

5、，且胎牛血清中动物源性成分复杂，不利于研究成果的临床转化。面对体外培养的干细胞另一难题就是分离，国内外文献中报道的分离技术有免疫磁珠分离技术、流式细胞术等，但免疫磁珠分离技术价格昂贵，不利于广泛开展；流式细胞术需要标记细胞，且不易无菌操作，都存在一定弊端。体外构建人角膜缘上皮片的方法也有多种，国内外文献中报道较多的方法是气液界面，但是该方法多在SHEM培养体系下完成；文献报道中研究比较热的培养方法是3D培养法，但是构建细胞外支架的基质多是鼠源性的，价格昂贵，构建的上皮片在眼科临床上并没有广泛应用。第一部分活体及离体条件下对角膜上皮干细胞的定

6、位研究目的：本研究通过活体激光扫描角膜共焦显微镜及免疫荧光染色技术对角膜上皮干细胞进行定位研究，为角膜上皮干细胞的体外培养提供取材范围指导。方法：收集2009年9月～2012年9月来河南省眼科研究所就诊的单侧角膜缘干I摘要细胞缺乏患者，使用活体激光扫描角膜共焦显微镜检查患者双眼，健侧眼为对照。扫描方位依次为中央角膜及上、下、左、右方的角膜缘，记录角膜及角膜缘上皮各层、前弹力层的扫描图像，对检查资料进行研究和统计学分析。眼球材料来自于河南省眼库，切取角膜中央和角膜缘组织，组织包埋剂包被、切片，切片厚度5--7岫：免疫荧光染色技术检测p63、A

7、BCG2、CKl9、CD29、K3、Connexin43和involucrin在角膜中央及角膜缘上皮层的表达，激光扫描共焦显微镜观察拍照并记录分析。由内向外将角膜缘上皮层三等分，实时荧光定量PCR检测不同部位的角膜缘上皮层中p63、ABCG2及K3的mRNA表达，采用2-△△c1法进行相对定量分析。结果：共有24位患者确诊为单侧角膜缘干细胞缺乏，男19例，(36．004-12．24)岁，女5例，(38．604-5．41)岁。健侧眼在活体激光扫描角膜共焦显微镜下的表现：角膜中央各层细胞形态清晰可见，前弹力层可见平行走行的神经纤维；角膜缘上皮层

8、中可见Vo垂栅栏、栅栏问形成钉突结构及伴行的色素细胞。患侧眼示角膜中央典型的上皮细胞形态消失，结膜化的角膜区域出现结膜上皮细胞、杯状细胞以及角膜新生血管；前弹力层平行走行的神经纤