人脐带间充质干细胞蛛网膜下腔移植治疗脊髓损伤的实验研究

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1、圆燃嬲论文题目：人脐带问充质干细胞蛛网膜下腔移植治疗脊髓损伤的实验研究作者姓名：高健伟学科、专业：外科学学位类型：学术学位型研究方向：骨外科指导教师：魏开斌教授入学时间：2010年9月论文工作起止时间：2012年3月-2013年2月人脐带问充质干细胞的培养、鉴定、冻存复苏和脊髓损伤模型的建立19材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯19结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：18：：=H木⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯J‘o讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：19结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31第二部分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32人脐带问充质干细胞蛛网膜下腔移植治疗脊髓损伤的疗效观察⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32材料和方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4l：：口木⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯Ⅲ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘-J．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯52全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53附图I⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．54附图Ⅱ⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。55参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯67综j《昼⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7：；致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．83原创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8417469¨1录一目～一～要要明～分摘摘说～部文文号言一中英符前第人脐带间充质干细胞蛛网膜下腔移植治

5、疗脊髓损伤的实验研究研究生：高健伟专业：外科学骨科导师：魏开斌教授中文摘要第一部分人脐带间充质干细胞的培养、鉴定、冻存复苏和脊髓损伤模型的建立目的1．探讨人脐带间充质干细胞原代培养方法和鉴定等，观察其生物学特性。2．探讨干细胞爬片培养，GDNF和BDNF荧光表达。3．探讨大鼠损伤脊髓模型的正确建立。方法1．原代细胞培养和流式鉴定1．1获得足月、健康剖腹产产妇的新鲜、无菌的新生儿脐带，提取人脐带华尔通胶或叫沃顿胶(Whartoncsjelly，WJ)，行组织贴壁法，应用DMEM／F12进行体外原代培养和传代培养

6、，并对其分离、纯化和鉴定。1．2将脐带华尔通胶剪成约lmmxlmmx1mm大小，行组织贴壁法放置于6孔培养板中，随后把培养板放在370C温箱中1．5小时进行贴壁。组织贴壁后取出将预制不锈钢网(1mmxlmm大小框径)置于组织块上方，加入DMEM／F12进行培养，观察不锈钢网在培养过程中对细胞数量的影响。1．3采用流式细胞仪检测鉴别CD24、CD34、CD44、CD90在干细胞表面的表达。1．4细胞的冻存和复苏遵循慢冻速融的原则(4℃冰箱30miIl一．20℃冰箱冷冻室30min_--80。(2低温冰箱过夜一一

7、194。C液氮保存。)。细胞培养传代至2代时严格按照步骤原则进行细胞的冻存，储存于液氮中；移植时将其取出复苏，培养传代至第4代细胞进行标记移植。2．人脐带问充质干细胞爬片培养，GDNF和BDNF荧光表达3．脊髓损伤模型的建立3．1Wistar大鼠脊髓损伤模型的建立参照Wamil等制作方法，按落体致伤原理制成一撞击装置，撞击体头端3mm，长度3．5cm，撞击体重量89，下落高度2cm，撞击体致伤的冲击力89×3．5cm×2cm。大鼠称重2509左右，10％水合氯醛0．7ml／1009的剂量行腹腔内注射麻醉，将大

8、鼠四肢固定于自制的固定板上。行手术区域碘伏消毒，依次切开暴露脊髓，安装自制打击器，定位T10脊髓上方，按预定方案行脊髓打击伤。所有大鼠脊髓打击模型造模操作及结果均一致，B组、C组、D组、E组术后即刻进行BBB评分均为0．00-3：0．00，同时观察大鼠神智意识、精神状态、心率、呼吸和四肢活动灵活性，同时观察注射后有无异常不良反应。3．2收集干细胞观察干细胞融合达80％．90％时0．25％胰酶一EDT