血清miR-300在骨肉瘤中早期诊断与判断预后中的价值及机制研究.pdf

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1、分类号：R604密级：公开学校代码：11065学号：Y0115130089专业博士学位论文血清miR-300在骨肉瘤中早期诊断与判断预后中的价值及机制研究作者姓名刘建东指导教师李书忠教授专业领域外科学（骨外）培养单位医学部答辩日期2018年5月18日血清miR-300在骨肉瘤中早期诊断与判断预后中的价值及机制研究摘要研究目的：检测骨肉瘤患者血清标本中miR-300的表达水平，分析血清miR-300是否可作为骨肉瘤早期诊断的分子指标。而后，明确血清miR-300的表达水平与骨肉瘤患者临床病理分期之间是否存在相关性；分析

2、血清miR-300的表达水平与骨肉瘤患者术后五年总体生存期和无进展生存期之间的关系；miR-300表达水平与骨肉瘤患者预后的关系。最后，进一步明确miR-300对骨肉瘤细胞系增殖、凋亡、周期、转移和侵袭能力的影响。研究方法：1.通过实时定量聚合酶链式反应qRT-PCR检测骨肉瘤细胞培养基中miR-300的表达，以确定miR-300是否为分泌型miRNA。2.收集2004年12月至2012年12月于解放军401医院和青岛大学医学院附属医院就诊的114例骨肉瘤患者，其中接受根治性手术治疗97例，接受姑息性手术治疗17例。

3、所有入选本研究的骨肉瘤患者均具有完整的临床病理资料和术后随访资料。3.通过qRT-PCR检测114例骨肉瘤患者血清和114例健康对照血清中miR-300的表达，以明确miR-300是否在骨肉瘤患者和健康对照血清中差异表达。4.通过qRT-PCR检测骨肉瘤患者术前、术后骨肉瘤患者血清中miR-300的表达变化，以进一步明确血清miR-300的表达与骨肉瘤组织切除的相关性。5.通过qRT-PCR检测转移与未转移、复发与未复发骨肉瘤患者血清中miR-300的表达差异，转移与未转移骨肉瘤患者血清miR-300的表达差异，以明

4、确miR-300与骨肉瘤患者转移及复发之间的关系。6.通过qRT-PCR检测骨肉瘤组织中miR-300的表达，并分析骨肉瘤组织中的miR-300的表达与同一骨肉瘤患者血清中miR-300的表达的相关性，以进一步明确骨肉瘤患者血清中miR-300的是否与骨肉瘤组织中miR-300的表达直接相关，从而确定骨肉瘤组织是否为血清miR-300的直接来源。7.利用ROC曲线计算灵敏度、特异度及曲线下面积，进一步评估血清miR-300在骨肉瘤患者中的诊断效率及血清miR-300是否可作为骨肉瘤患者有效的分子诊断指标。8.利用卡方

5、检验分析血清miR-300与骨肉瘤患者临床病理特征之间的关系，利用K-M生存曲线分析血清miR-300余骨肉瘤患者五年总体生存率及无进展生存率之间的关系，利用Cox风险比例模型单因素及多因素分析血清miR-300是否可作为判I断骨肉瘤患者预后的独立预测指标。9.利用干涉技术，沉默骨肉瘤细胞系中miR-300的表达水平，而后利用细胞增殖MTT实验、细胞凋亡实验、细胞周期实验、Trasnwell细胞转移和侵袭实验，检测了miR-300对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、周期、侵袭转移等恶性表型的影响。研究结果：1.miR-300在骨

6、肉瘤细胞培养基中的表达。miR-300可被骨肉瘤细胞系U2OS和MG63分泌至细胞培养基之中，更为重要的是，随着细胞培养时间的延长，培养基中miR-300的表达水平越高，此外，随着初始培养骨肉瘤细胞数目的增高，培养基中miR-300的表达水平越高。本部分实验结果表明，miR-300为分泌型miRNA。2.骨肉瘤患者及健康对照血清标本中miR-300的表达本部分我们检测了114例骨肉瘤患者和114例健康对照标本中血清miR-300的表达水平。结果显示：血清miR-300在骨肉瘤患者中的表达水平显著高于健康对照，经t检验

7、，两组间的差异具有统计学意义（P<0.05）。提示根据血清miR-300表达水平可有效的区分骨肉瘤患者与健康对照。3.术前和术后骨肉瘤患者血清中miR-300的表达变化术后血清miR-300的表达水平较术前miR-300的表达水平降低，经t检验分析，术前术后血清miR-300的表达水平差异有统计学意义（P<0.05）。以上结果说明，血清miR-300在骨肉瘤血清中的表达具有一定的特异性，随着骨肉瘤组织的切除，血清miR-300的表达水平也随之下降。而后，我们进一步检测了接受根治性手术和姑息性手术的骨肉瘤患者血清miR

8、-300的表达差异，结果显示，在根治性手术组，术后血清miR-300的表达水平较术前血清miR-300的表达水平降低，经t检验分析，术前术后血清miR-300的表达水平差异有统计学意义（P<0.05），而在姑息性手术组，术后血清miR-300的表达水平较术前无明显变化，经t检验，差异无统计学意义（P>.05）。本部分结果提示，血清miR-300