舒尼替尼耐药的肾癌786-O细胞系的建立及耐药机制的研究.pdf

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1、分类号：R737.11密级：公开学校代码：11065学号：y0115130102专业博士学位论文舒尼替尼耐药的肾癌786-O细胞系的建立及耐药机制的研究作者姓名骆磊指导教师孙立江（主任医师）专业领域外科学（泌尿外科）培养单位医学部临床医学系答辩日期2018年5月13日舒尼替尼耐药的肾癌786-O细胞系的建立及耐药机制的研究摘要目的:用低浓度递增方法建立耐舒尼替尼的786-O细胞系，比较人肾透明细胞癌786-O细胞株针对舒尼替尼的敏感株和耐药株中基因表达差异，寻找舒尼替尼耐药性相关靶点，探索舒尼替

2、尼耐药性发生的机制。方法：自2.5μmol/L起逐渐增加舒尼替尼浓度作用于786-O细胞，每天观察细胞的生长状态，待细胞生长至覆盖瓶底约90%左右时按1:2进行传代并冻存细胞以备使用。细胞传代大约15代左右并且细胞能够在该浓度药物作用下稳定生长并传代后，增加药物浓度至5μmol/L继续筛选。每次在同一药物浓度作用细胞大约传代15代左右稳定后增加药物浓度，经过多次传代最终获得耐舒尼替尼的786-O细胞（786-O/S），用MTT法检测两种细胞的半数抑制浓度IC50，证实耐药细胞建立成功。通过细胞形

3、态学检测细胞变化、划痕实验验证细胞迁移能力、克隆增殖实验验证细胞增殖能力、细胞周期验证这两种细胞细胞周期的差异性。使用基因芯片技术分别对舒尼替尼敏感患者血样、舒尼替尼耐药患者血样、人肾透明细胞癌786-O细胞株、耐舒尼替尼的人肾透明细胞癌786-O/S细胞株进行分析，分别获得原始标本和耐药标本之间的基因表达调节情况。并通过GO及Pathway分析差异基因的分布情况及功能所在。根据基因芯片分析结果，分析人血组和细胞组共有的差异基因，挑选出差异倍数高的基因并用PCR及Western加以验证，后用小干

4、扰RNA技术将舒尼替尼耐药细胞株中的差异基因沉默，以验证其耐药性的变化。结果：1.与786-O细胞相比较，耐药细胞在显微镜下呈现为浅蓝色，体积膨大，更加细长。在6μmol/L舒尼替尼的作用下，786-O/S的迁移速率明显优于亲代786-O，在48h时更为明显（P<0.001），迁移速率比接近2倍。结晶紫染色发现在1000个细胞组中，786-O/S组克隆数>50，而786-O组仅有6个。在500个和200个细胞组中，786-O/S组克隆数均明显多于786-O。细胞周期显示大部分停留在有丝分裂的G1

5、期。经过72h处理，786-O细胞半数抑制浓度为8.15μmol/L，而耐药细胞株则为24.57μmol/L，耐药指数为3.01，成功建立了人肾透明细胞癌786-O耐舒尼替尼细胞株，为后续实验打下了基础。2.分别提取人血敏感和耐药细胞、肾癌786-O细胞系原始和耐药株细胞的总RNA，进行四组细胞量及质量检测，总RNA质控报告示标本总体质量良好，所有样品的杂交评估结果均正常。采用表达谱芯片分别检测人血敏感细胞、人血耐药细胞、786-O原代细胞、786-O耐药细胞样本的mRNA表达谱，根据倍数变化值

6、进行差异基因筛选，筛选标准设定为上调或下调的倍数变化≥2.0。结果表明：786-O耐药细胞与786-O原代细I胞相比，在被检测的有效基因中,差异基因共2,692个，上调基因1,235个，下调基因1,457个；人血耐药细胞与人血敏感细胞相比，在被检测的有效基因中,差异基因共1,922个，上调基因906个，下调基因1,016个。上述数据说明在耐药细胞系建立过程中，786-O耐药细胞与786-O原代细胞相比，人血耐药细胞与人血敏感细胞相比，均存在较大的基因表达差异。差异基因、特别是表达水平上调的差异基

7、因，将是可能具体涉及到细胞耐药性产生的机理。采用GO富集分析人血细胞敏感株和耐药株的细胞差异表达基因的生物学特点，发现比较有统计学差异（P＜0.05）的生物学过程显著富集于胞外基质构成、细胞粘附、心脏形态发生、视黄醛代谢过程、机械刺激响应、肌纤维分化、细胞蛋白复合物组装、免疫应答控制、钠离子转运等。细胞成分显著富于：胞外区、细胞外隙、细胞膜、细胞质及成分、固有膜、内质网、浆膜、等离子体膜部分、内质网膜、蛋白质的胞外基质、细胞表面、膜骨架、纤维蛋白原复合物、钙通道复合物等。分子功能显著富集于钙离子

8、结合、肝素结合、胞外基质结构组成、化学排斥物活性、胆汁酸跨膜转运活性、血小板源生长因子结合、肌肉结构组成、蛋白结合桥连、整合蛋白结合等。而人肾癌786-O细胞的生物学过程显著富集于干扰素信号通路、病毒反应、细胞粘附、病毒基因组阴性复制、病毒防御反应、细胞分化、平滑肌细胞增殖阳性调节等。细胞成分显著富于：细胞外基质、突触后膜、蛋白质细胞外基质、内质网、胞外区、细胞骨架、细胞表面、细胞连接、基底膜、溶酶体等。分子功能显著富集于肌动蛋白结合、胶原结合、肝素结合、ATP结合、螺旋酶活性、CD4受体结合、