加工番茄SlAGO4B基因功能鉴定.pdf

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1、分类号：密级：公开学号：2015200528单位代码：10759石河子大学硕士学位论文加工番茄SlAGO4B基因功能鉴定学位申请人许鹏程指导教师郑银英申请学位门类级别理学硕士学科、专业名称细胞生物学研究方向细胞信号转导所在学院生命科学学院中国·新疆·石河子2018年6月FunctionIdentificationofSlAGO4BGeneinProcessingTomatoADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirem

2、entsfortheDegreeofMasterofNaturalScienceByXuPengcheng(cellbiology)DissertationSupervisor:ZhengYin-yingJun,2018摘要AGO蛋白是RNA沉默途径的核心蛋白，在RISC中扮演重要角色，AGO蛋白是一类保守蛋白，含四个保守的结构域AgoN、PIWI、PAZ和MID域。其中AgoN参与小RNA的解旋过程；PAZ和MID负责小RNA的识别和结合；PIWI具有类似RNaseH的功能，使得AGO蛋白具有催化切割功能，在RNA沉

3、默途径中起着重要作用。本文从加工番茄cDNA文库，通过PCR技术获得SlAGO4B基因，分析了SlAGO4B的亚细胞定位以及与CMV2b蛋白的相互作用，构建SlAGO4B基因过量表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化获得转基因加工番茄。实验结果如下：1.SlAGO4B生物信息学分析：利用NCBI数据库，获得加工番茄SlAGO4B序列信息，设计引物利用PCR扩增获得SlAGO4B基因。利用ORFFinder在线软件，预测SlAGO4B开放阅读框和氨基酸序列；通过ExpasyProtparma分析蛋白质分子量、等电点及氨基酸组

4、成特征；信号肽和二级结构利用SignalP和SOPMA在线分析；蛋白结构域通过SMART数据库分析；利用MEGA7软件构建AGO蛋白系统进化发育树。结果显示SlAGO4B基因全长2742bp，编码913个氨基酸，包含了AGO蛋白保守的AgoN、PIWI、PAZ和MID域，还有DUF1785和AgoL2两个结构域。SlAGO4B为亲水性蛋白，不含有信号肽，不属于分泌型蛋白；利用MEGA7对番茄AGO蛋白家族和拟南芥AGO蛋白家族做系统进化树分析发现SlAGO4B与AtAGO4在蛋白进化同处于一个进化支，推测二者功能上可能

5、存在一定的相似性。2.SlAGO4B亚细胞定位：将GFP基因与SlAGO4B基因进行融合，构建35S:GFP-SlAGO4B融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化洋葱表皮细胞，利用激光共聚焦显微镜观察发现在洋葱表皮细胞的细胞核中出现荧光信号，同时遗传转化烟草在烟草原生质体中荧光信号主要出现在细胞核中，结果表明SlAGO4B定位在细胞核。3.利用GAL4酵母系统验证CMV2b与SlAGO4B互作：将克隆SlAGO4B基因与酵母载体pGAD-T连接，构建pGAD-SlAGO4B，CMV2b与诱饵载体pGBK-T连接，构建pGBK

6、-CMV2b。将此两个载体共转化AH109中，经氨基酸缺陷验证，与对照相比，发现pGAD-SlAGO4B和pGBK-CMV2b在SD/-Leu-Trp-His缺陷培养基中生长，说明SlAGO4B与CMV2b能够激活下游报告基因，CMV2b与SlAGO4B可能存在相互作用。4.SlAGO4B基因植物过量表达载体构建及遗传转化：将过量表达载体35S:SlAGO4B利用农杆菌介导的方法遗传转化加工番茄，获得再生番茄，提取再生番茄总DNA，经PCR鉴定，获得过量表达番茄5个株系，为研究SlAGO4B基因功能提供遗传材料。关键词

7、：加工番茄；亚细胞定位；酵母双杂交；遗传转化IAbstractAGOproteinisthecoreproteinofRNAsilencingpathwayandplaysanimportantroleinRISC.AGOproteinisakindofconservedproteincontainingfourconserveddomains:AgoN,PIWI,PAZandMIDdomain.AgoNdomainisinvolvedintheunwindingprocessofsmallRNA.ThePAZdoma

8、inandtheMIDdomainareresponsiblefortheidentificationandbindingofsmallRNAs.ThePIWIdomainhasafunctionsimilartoRNaseH,whichmakestheAGOproteinhaveacatalyticcleavagefunctio