sirna干扰bcl2表达联合131碘治疗低分化甲状腺癌的实验研究

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1、AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofDoctorStudyingtheTreatmentofsiRNA—BCL2Combinedwith131IodineforPoorlyDifferentiatedThyroidCarcinomaBy：RuihuaWangSupervisor：BaopingLiuMedicalImagingandNuclearMedicineTheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversi

2、tyMay2013原创性声明IIllIlUllIllIIIIIlUIY2313911本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：≥日期：砂)产厂月硅日，／学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保

3、留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子舨，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：眺劾(；年f月哆日摘要siRNA干扰BCL．2表达联合131碘治疗低分化甲状腺癌的实验研究目的：制备低分化甲状腺癌(poorlydifferentiatedthyroidcarc

4、inoma，PDTC)细胞模型，研究BCl2抗凋亡作用的机制及siRNA．BCl2在PDTC细胞中的促凋亡作用，观察siRNA．BCl2与131碘联合应用在PDTC细胞中的作用，初步探讨siRNA干扰BCl2表达用于PDTC治疗的可行性，期望能为低分化甲状腺癌的靶向治疗提供新的靶点。方法1．PDTC细胞模型的制备及鉴定用低剂量¨1碘辐射滤泡状甲状腺癌FTC．133细胞系，分别于oh、2h、8h、24h和48h后更换正常培养基继续培养6h，用丫计数仪测定细胞的放射性计数，筛选细胞放射性计数下降最多的辐射时间为最佳时间

5、。用WesternBlot的方法检测最佳辐射时间点的细胞131碘作用后甲状腺特征性蛋白NIs、TPO、TSHR的表达变化，从而评价细胞分化程度；用平板克隆形成试验评价FTC．133细胞经131碘作用一定时间后增殖能力的变化。2．BCL2调节细胞凋亡及siRNA．BCL2促进PDTC细胞凋亡的初步研究构建pcDNA3．1．BCl2质粒，转染B35细胞系，制备稳定表达BCl2的细胞系。用BCl2抗体和内质网特异性抗体进行免疫荧光染色，用激光共聚焦显微镜观察BCl2在细胞内表达的定位情况。将稳定表达BCl2的B35细胞经

6、糖氧剥夺(oxygenglucosedeprivation，OGD)处理，在激光共聚焦显微镜下观察细胞色素C的表达变化及细胞内分布情况；用WesternBlot的方法检钡qOGD作用后细胞内凋亡下游蛋(jCaspase3的表达变化；用LDH试剂盒检测细胞活性的变化。化学合成siRNA．BCL2署IasiRNA-NC，体外转染PDTC细胞，从mRNA水平和摘要蛋白水平评价siRNA沉默细胞[勾BCL2表达的效率。PDTC细胞经OGD作用后，检测细胞内凋亡下游蛋[兰ICaspase3的表达变化及LDH含量变化，评价si

7、RNA．BCL2促进PDTC细胞凋亡的作用。3．siRNA．BCL2转染联合131碘辐射在PDTC细胞中的作用研究PDTC细胞中siRNA．BCL2和131碘联合应用的实验分四组：双阴性组(转染siRNA．NC，无131碘辐射)、siRNA．BCL2单独应用组(转染siRNA．BCL2，无131碘辐射)、131碘单独应用组(转染siRNA．NC，有131碘辐射)和联合应用组(转染siRNA．BCL2，有131碘辐射)。PDTC细胞转染siRNA。BCL2或siRNA-NC24h后，加入”1碘(每个35mm培养板加入

8、609Ci”1碘)作用20min后，转入正常培养环境中常规培养。6h后，用Y计数仪测定双阴性组和siRNA．BCL2单独应用组摄碘能力；用WestemBlot检测细胞内凋亡下游蛋白Caspase3的表达，用LDH试剂盒测定LDH含量，用流式细胞仪AnexinV／PI双染法测定四组PDTC细胞的凋亡率。翻e甲二日木1．PDTC细胞模型的制备及鉴定低剂量的131