opn经ppic与cd147结合及对人膝oa滑膜细胞mmp-3和tnf-α表达的影响

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1、中图分类号R684．3UDC616．7博士学位论文学校代码!Q§三三密级公开OPN经PPIC与CDl47结合及对人膝OA滑膜细胞MMP．3和TNF．仅表达的影响OPNcombinedwithCD147viaPPICandtheeffectonMMP．3andTNF．QinHumankneeOAsynoviocytes作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：副指导教师：徐迈临床医学骨科学湘雅医院雷光华教授陈翔教授中南大学＼2013年5月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及

2、取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：缝日期：兰堕年￡月卫Et学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科

3、学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：趟导师签名复丝日期：型年』月上日博士学位论文中文摘要OPN经PPIC与CDl47结合及对人膝OA滑膜细胞MMP．3和TNF．伐表达的影响摘要：目的：本研究拟比较正常人膝滑膜细胞与OA滑膜细胞中骨桥蛋白(osteopontin，OPN)与其可能受体CDl47的结合情况，探讨其结合途径，并进一步观察其结合后对滑膜细胞生长和增殖及下游细胞因子表达的影响，从而探究OPN与CDl47结合在骨关节炎发病中的作用和意义。方法：1

4、．培养鉴定人膝关节OA滑膜细胞和正常滑膜细胞。2．针对OPN基因SPPl及CDl47基因BSG构建shRNA慢病毒载体，即OPNshRNA和CDl47shRNA，包装获得高滴度病毒后转染正常人膝滑膜细胞与人膝OA滑膜细胞。3．体外培养人膝正常滑膜细胞和OA滑膜细胞，qPCR检测人膝正常滑膜细胞与OA滑膜细胞中OPN、CDl47、PPIC、MMP一3及TNF．0【的mRNA表达量；予以PPIC干预后采用免疫共沉淀法检测两种细胞OPN与CDl47的结合情况。4．将体外培养人膝正常滑膜细胞和OA滑膜细胞各分成7组，共14组，

5、分别予以添加OPN、OPNshRNA、CDl47、CDl47shRNA、OPN+CDl47、OPN+CDl47+PPIC培养：N．A组：正常滑膜细胞空白对照组；N．B组：正常滑膜细胞+OPN；N．C组：正常滑膜细胞+OPNshRNA；N。D组：正常滑膜细胞+CDl47；N．E组：正常滑膜细胞+CDl47shRNA；N．F组：正常滑膜细胞+OPN+CDl47；N．G组：正常滑膜细胞+OPN+CDl47+PPIC：OA．A组：OA滑膜细胞空白对照组：OA．B组：OA滑膜细胞+OPN；OA．C组：OA滑膜细胞+OPNshRN

6、A；OA—D组：0A滑膜细胞+CDl47；OA—E组：OA滑膜细胞+CDl47shRNA；OA．F组：OA滑膜细胞+OPN+CDl47；OA．G组：OA滑膜细胞+OPN+CDl47+PPIC。观察细胞克隆形成评价生长情况，MTT法测定增殖情况，采用Westernblot检测MMP一3和TNF一仪表达情况。结果：1．采用II型胶原酶及胰蛋白酶复合酶消化法成功分离培养博士学位论文中文摘要原代滑膜成纤维细胞，白第4代起免疫细胞化学结果稳定。2．针对SPPl及BSG成功构建shRNA慢病毒载体，并包装出108TU／ml数量级滴

7、度的慢病毒颗粒。感染人滑膜细胞示该病毒以MOI=100使用感染效果最好。3．正常滑膜细胞OPN、CDl47、PPIC、MMP．3及TNF．IX的mRNA表达量分别为：1．00324022+0．076389036、O．99952589土0．045154528、1．00506933土O．110442982、1．00597389士O．10024154、1．00200722土0．077274527；OA滑膜细胞OPN、CDl47、PPIC、MMP．3及TNF．仅的mRNA表达量分别为：3．62885022士0．35090990

8、2、3．45538689土O．307717070、11．46923478士O．199208822、3．27354856土O．303610376、4．59285122土0．374560116，OA组与正常组比较各基因表达有显著性差异(P