foxe-1甲基化与表达的关联分析及其与结直肠癌的相关性研究

《foxe-1甲基化与表达的关联分析及其与结直肠癌的相关性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据复旦大学博士学位毕业论文博士学位论文FOXE．1甲基化与表达的关联分析及其与结直肠癌的相关性研究院专系：肿瘤医院业：肿瘤学博士研究生：龙亚东研究生导师：蔡三军教授导师组成员：徐烨教授蔡国响副教授资金资助：国家自然科学基金(编号：81001055)教育部高等学校博士点新教师基金(编号：200802461108)万方数据复旦大学博士学位毕业论文目录删㈣㈣'Irl眦lg舢，

2、11

3、㈣JillIIIY2700499。中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5第一部分FOXE．1甲基化与表达的关联分

4、析及其预后判断价值的研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯22结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34第二部分文献综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯一39第三部分致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48万方数据复且大学博士学位毕业论文中文摘要：目的：FOXEl(FolkheadboxE1)基因是叉头结构域蛋白家族的重要一员，在甲状腺

5、胚胎发育中扮演重要角色。研究发现，FOXEl基因纯合突变可以引起甲状腺发育不全，导致先天性甲状腺功能低下和腭裂等各种畸形。近年的研究发现，FOXEl基因和恶性肿瘤的发生也具有密切联系，甲状腺腺癌和鳞状细胞癌(皮肤、肺、食管等)与FOXEl基因多态性或突变紧密相关，FOXEl基因是这些恶性肿瘤的易感基因。在胰腺癌和乳腺癌中，均有FOXEl基因启动子高甲基化的报道。但在结直肠癌中，尚未见FOXEl基因的相关研究。本研究的目的在于通过检测结直肠癌组织与配对正常肠粘膜中FOXEl启动子区域CpG岛的甲基化情况，结合其在mRNA转录水平及蛋白表达水平的检测，初步揭示FOXEl

6、基因启动子区域CpG岛的甲基化调控其表达及与结直肠癌的发生具有密切相关性。材料与方法：细胞株：肠癌细株：HCTll6，RKO,LSl47(上海中科院细胞室)组织标本：83例的结直肠癌组织标本均来自2008年12月一2010年3月复旦大学附属肿瘤医院大肠外科手术后标本，均具有配对的距离癌灶至少5cm的癌旁正常粘膜组织。所有标本均为术前未行新辅助放化疗的初治患者，所有手术均为根治性手术切除，并且术后均具有明确的病理诊断。所有肿瘤标本及其对应的正常粘膜组织(距离肿瘤病灶5cm以上)取材时问不超过术后半小时且均保存在一196度液氮中，其中提取RNA的组织均为RNALater

7、保存。所有病人均签署过知情同意书。病理分期严格按照AJCC(美国癌症联合委员会)分期第七版。芯片初筛：大肠外科蔡国响博士前期应用全基因组甲基化芯片(1lluminaHumanMethvIation27)筛选结直肠癌相关甲基化基因，发现FOXEl等差异甲基化基因，从而为本研究提供候选的目标基因。实验方法：1．采用甲基化特异性PCRIMSP)方法检测细胞株中基因FOXEl启动子甲基化状态，对其中MSP阳性细胞株采用去甲基化试剂5-aza一2．CdR干预。干预前后分别采用万方数据复旦大学博士学位毕业论文定量甲基化(qMSP)和TaqMan定量PCR(qRT-PCR)检测F

8、OXEl甲基化水平和表达水平。2．在83例结直肠癌组织及其配对癌旁正常粘膜组织中提取DNA并亚硫酸氢盐修饰．采用定量甲基化(qMSP)方法检测基因FOXEl启动子甲基化水平，对有RNAlater保存的40例癌组织及其配对癌旁正常粘膜组织抽提RNA，采用TaqMan定量PCR(qRT-PCR)方法检测FOXEl表达水平。数据分析：根据样本、标准品中目标基因以及内参基因实时定量甲基化PCR扩增的Ct值计算甲基化比例(percentageofmethylatedreference，PMR)，PMR=100×(目标基因／内参)样本／(目标基因／内参基因)标准品，PMR<4定

9、义为阴性结果(非甲基化)，PMR≥4定义为阳性结果(甲基化)。将每个样本目标基因CT值与内参cT值求deltaCT值，将2。劬作为目标基因相对表达量。采用配对卡方检验分析83对癌与癌旁FOXEl基因启动子区域甲基化水平差异，PearsonX2检验分析83例癌组织中FOXEI基因甲基化与临床病理特征的关联性，采用配对t检验分析40对癌与配对正常组织之间FOXEl表达差异，独立样本t检验分析40例癌组织中FOXEI启动子区域甲基化水平与表达之间的关联性。采用Kaplan．Meier检验分析甲基化与预后关系，所有检验均为双侧，P