cryoloop玻璃化冷冻对小鼠4细胞期、8细胞期及囊胚期胚胎发育潜能的影响

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1、河北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师(或指导小组)的指导下，由本人独立完成。本学位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有。河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要内容相关的论文，第一署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名：黝秀导师签章撇二级学院领导盖章：l’≥≤矽；年莎月媚河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研

2、究成果，除了文中特别加以标注和致谢等内容外，文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：荔键眵易目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3研究论文Cryoloop玻璃化冷冻对小鼠4细胞期、8细胞期及囊胚期胚胎发育潜能的影响前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6且Ⅱ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．17附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．19附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．23讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．24结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．28参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一29综述玻璃

4、化冷冻技术在人类辅助生殖技术中的应用⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．37致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．54中文摘要Cryoloop玻璃化冷冻对小鼠4细胞期、8细胞期及囊胚期胚胎发育潜能的影响摘要1978年，世界第一例试管婴儿LouisBrown诞生的消息传来，世界各国的人们集聚无比兴奋的心情与追逐先进的欲望，纷纷开始开展这项技术。随着辅助生育技术(assistedreproductivetechnology，越玎1的发展

5、，胚胎冷冻技术已经成为其发展不可分割的一部分。玻璃化冷冻是一种比较新的冷冻保存方法，是在高浓度的冷冻保护剂的存在下，使细胞快速冷冻，形成玻璃态，避免了细胞内外冰晶形成对细胞的破坏作用。由于其大大简化了冷冻程序，缩短了冷冻时间，不需要昂贵的冷冻设备，提高了冷冻效果，具有广阔的应用前景。影响玻璃化冷冻的因素很多，首先冷冻保护剂的毒性是玻璃化冷冻的最大障碍，为了降低其毒性作用，人们不断改进冷冻技术和冷冻载体，提高冷冻速率。其次胚胎本身的原因也逐渐被人们所重视，理论上讲，玻璃化冷冻可以用于种植前胚胎的任何阶段，

6、但由于胚胎从1细胞到囊胚，细胞体表面积、细胞膜成分及通透性不断发生改变，冷冻效果有明显差异。虽目前卵裂期及囊胚期的玻璃化冷冻技术已在众多中心应用，但仍处于应用的初期阶段，各家报道的胚胎复苏率差异很大。提高玻璃化冷冻后胚胎复苏率的稳定性，建立公认的玻璃化冷冻方案，并研究玻璃化冷冻对各个发育阶段胚胎的影响，是当前玻璃化冷冻急需了解的问题。本研究以Cryoloop为载体对不同发育阶段小鼠胚胎冷冻，期望此方法在胚胎冷冻的临床应用提供参考价值。目的：实验以小鼠4细胞期、8细胞期及囊胚期胚胎作为实验对象，对卵裂期胚

7、胎及囊胚期进行玻璃化冷冻研究，探讨卵裂期及囊胚期胚胎玻璃化冷冻在临床的应用。方法：1取材：昆明小鼠以PMSG常规促排卵，体外受精，分别于HCG后48～50小时、60--一62小时和85～96小时取4细胞期、8细胞期和囊胚期胚胎分三组进行玻璃化冷冻。以相应发育阶段未经冷冻胚胎为对照绍。中文摘要2玻璃化冷冻与复苏：胚胎首先用预平衡液7．5％(v／v)EG、7．5％(v／v)DMSO平衡2分钟；然后转入15％(v／V)EG、15％(v／v)DMSO、0．65Msucrose的玻璃化冷冻液中，时间控制在25—3

8、0秒。胚胎复苏采用0．33M、0．2M、0Msucrose复苏液，梯度稀释逐步洗脱冷冻保护剂，平衡时间分别为2min、3rain和5min。3结果判断：冻融后，在倒置显微镜下观察根据胚胎解冻后的形态完整性来判断胚胎存活情况，用存活率表示；其次是在体外的继续发育能力，用囊胚形成率和孵出率表示。结果：冻融后的4细胞期、8细胞期及囊胚期胚胎的形态学无异常；共冷冻了胚胎291枚，存活272枚，存活率为93．5％(272／291)；三组胚胎冻融后的存