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1、浙江林学院学报2006,23(3):265～269JournalofZhejiangForestryCollege 文章编号:100025692(2006)0320265205矮化杉木蛋白质组的差异凝胶电泳分析111121黄华宏,童再康,朱玉球,高燕会,许长寿,何福基(1.浙江林学院林业与生物技术学院,浙江临安311300;2.浙江省临安市马啸乡林业站,浙江临安311323)摘要:建立具有高分辨率和稳定性的矮化杉木Cunninghamialanceolata叶片蛋白质的双向电泳图谱,研究杉木矮化突变的机理。取同一生长环境下的野生型杉木及矮化突变型杉
2、木新梢顶端的叶片,液氮研磨成粉末后用改良TCA2丙酮沉淀法提取总蛋白,分别用CY2和CY3标记,用DIGE技术进行分析。与野生型杉木相比,在矮化突变型杉木的叶片组织中,有14个蛋白质表达水平显著增加,另外15个蛋白质表达水平显著下降。所得的29个差异蛋白质可能与杉木矮化突变的发生有关。图3表3参9关键词:林木遗传育种学;杉木;矮化突变;蛋白质组;差异凝胶电泳中图分类号:S72213文献标识码:A杉木Cunninghamialanceolata为我国特产,分布于长江流域以南各省区,是重要的速生用材针叶树种之一。杉木矮化突变体是速生木本植物中难得的珍贵种
3、质,为研究杉木生长的分子遗传学机制提供了理想材料。研究揭示其矮化突变的分子机制,对培育生长速度快、品质性状优良的杉木优株或无性系,以及促进林业生产的可持续发展都具有十分重要的意义。迄今为止,有关木本植物矮化突变机[1,2]制的报道主要集中在苹果Malussp.和柑橘Citrussp.等果树上。以往多数研究认为,果树的树体[3]大小受到植物生长调节剂的明显控制。矮化杉木发现于20世纪70年代,但至今尚无有关矮化杉木的研究报道。课题组经过20a的繁殖与不同地区栽培试验,发现杉木矮化性状遗传稳定(树高遗传重复力达0197)。一般条件下,10～20年生平均树
4、高为1186m,平均胸径仅412cm,树冠呈半球形,侧枝间距1～3cm,针叶质地嫩软,雌、雄球花生长异常,花极少且孢子叶球仅为正常杉木的25%左右。利用双向电泳技术找出差异蛋白并进一步克隆基因,已成为揭示突变机制的一种有效手段。如何[4]瑞锋等应用双向电泳分析了水稻Oryzasativa温敏叶绿素突变体的叶片蛋白,以探讨其突变原因。[5]李慧玉等则采用双向电泳研究了樟子松Pinussylvestrisvar.mangolica突变丛生枝的发生机理。课题组利用凝胶内差异显示电泳(differentialgelelectrophoresis,简称DIGE
5、)技术,以同一生长环境下的矮化突变型和野生型杉木新梢顶端的叶片作为研究材料,进行蛋白质组差异凝胶电泳分析,直接从差异表达的蛋白质水平来探讨杉木矮化突变的发生机理,为速生相关基因的分离和分子育种提供理论基础和科学依据。收稿日期:2005209219;修回日期:2006201219基金项目:浙江省科学技术攻关项目(2004C12022)作者简介:黄华宏,讲师,硕士,从事植物遗传育种研究。E2mail:huanghh@zjfc1edu1cn©1994-2007ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.All
6、rightsreserved.http://www.cnki.net266浙江林学院学报2006年6月1 材料与方法111 植物材料矮化突变型杉木和野生型杉木皆为5年生嫁接植株,生长在同一环境下,在杉木生长季采新梢顶端的叶片,放入冰瓶带回实验室。用剪刀稍作修剪,迅速用去离子水冲洗3次,滤纸轻轻吸干残余液滴,放入冻存管,迅速置于液氮中保存。112 主要试剂丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,尿素,硫脲,甘氨酸,TRIS,CHAPS,SDS,碘乙酰氨,固相pH干胶条(IPGstrippH3～10,NL,24cm),AmpholytepH3～10,22Dcleanu
7、p试剂盒,蛋白质定量试剂盒,均为Amersham公司产品;硫代硫酸钠,无水乙酸钠,为国产分析纯。所有溶液均用Mill2Q水配制。113 主要仪器EttanTMIPGphorTM等电聚焦电泳仪,EttanTMDALTSix垂直板电泳仪,Typhoon9400多功能荧光扫描成像系统,DeCyderImageQuantTMV510凝胶图像分析软件,均为Amersham公司产品;P80MX超速冷冻离心机,为Hitachi公司产品;UV8200分光光度计为Hitachi公司产品。114 实验方法[6]11411 叶片全蛋白的制备 叶片全蛋白的制备采用TCA2丙
8、酮沉淀法,具体步骤参照杨传平等的报道。所得样品蛋白质的浓度用22DQuantkit测定。11412 荧光标记
