骨髓基质干细胞治疗局部脑缺血作用机制研究

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1、博士学位论文学校代码：学号：10023b2009310骨髓基质干细胞治疗局部脑缺血作用机制研究所院：药物研究所姓名：丁晓霜指导教师：陈晓光研究员导师小组：陈晓光研究员MichaelChopp教授YiLi高级研究员学科专业：药理学研究方向：分子药理完成日期：二零一三年五月中国医学科学院北京协和医学院博士论文丁晓霜3tUnJes0ntIIemecIIanismsolBoneMarrowIr‘1J●‘·--‘n1r、lStromalCellstreatmentofstrokePh．D．Candidate：Xiaoshua

2、ngDingSupervisor：Prof．XiaoguangChenSpeciality：EntranceDate：Prof．MichaelChoppProLYiLiPharmacology09／2009lnstitute：InstituteofMateriaMedicaGraduateschoolofChinesePekingUnionMedicalCollege05，20132中国医学科学院北京协和医学院博士论文丁晓霜目录英文缩略词⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1中文摘要⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．13实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。24一、小鼠大脑中动脉栓塞模型的建立⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。24二、动物分组及取材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25I．静脉注射MSC和Cyciopa

4、mine及组织样本取材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．252．脑室内注射重组Shh蛋白及组织样本取材⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26三、细胞培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。271．MSC的提取及培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．272．星形胶质细胞的培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯273小鼠大脑皮层神经元原代培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯274．模拟体内缺血环境的氧糖剥夺培养神经元及星形胶质细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯285．神经元、星形胶质细

5、胞和MSC共培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．286小鼠大脑皮层原代神经元的不同处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28四、神经功能缺损评分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯281．改良神经功能缺损评分⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯282．足错步试验⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30五、组织染色⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．301．化学染色⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯302．免疫荧光染色⋯⋯⋯⋯⋯

6、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．303．定量分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31六、电子显微镜检测神经突触密度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．32七、Westernblotting杂交分析相关蛋白的表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．32八、激光显微切割术捕获星形胶质细胞⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。34九、定量Real．time．PCR检测相关基因表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。35十、ELISA检测神经元、星形胶质细胞和MSC共培养上清中Shh浓度⋯⋯⋯3

7、8中国医学科学院北京协和医学院博士论文丁晓霜十一、间接免疫荧光法检测神经元突起数目与长度⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39十二、统计学处理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．39结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40一、MSC治疗局部脑缺血后神经功能重塑过程中Shh信号途径的作用⋯⋯⋯401．MSC治疗对MCAo小鼠神经功能缺损的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯402．MSC治疗对MCAo小鼠神经轴索重塑性和突触重塑性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯4l3．MSC

8、治疗对MCAo小鼠局部缺血脑组织Shh及tPA蛋白表达的影响⋯⋯⋯474．MSC治疗对MCAo小鼠局部缺血脑组织局部Shh信号通路蛋白表达影响⋯525．MSC治疗对MCAo小鼠局部缺血脑组织Shh及tPA基因表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯53二、MSC细胞中Shh在蛋白水平及基因水平的表达情况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯541．MSC细胞Shh蛋白表达⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯