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1、第22卷第2期国外医学·生理、病理科学与临床分册Vol.22No.22002年4月ForeignMedicalSciences·SectionofPathophysiologyandClinicalMedicineApr.2002①双向电泳技术原理及其应用刘上峰 傅俊江 综述 李麓芸 审校(中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室,湖南长沙410078)摘要:双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术之一,本文对其基本原理、分辨率、可重复性、相关数据库、减法分析等作了介绍,并对其今后的发展方向作了展望。关键词:双向电泳; 蛋白质组; 数据库; 减
2、法分析中图分类号:R318133 文献标识码:A 文章编号:100121773(2002)0220197203 随着后基因组时代的到来,蛋白质组学应运而[2]点,一般的22DE能分辨1000～3000个蛋白质点。生。双向电泳(two2dimensionalelectrophoresis,22DE)常用改善分辨率的主要措施有:应用复杂的两作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另二性电解质,减少凝胶厚度(1.5～0.5mm)以及增大凝种是质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数[3]胶面积(30cm～40cm)。Humphery2Sm
3、ith等创立了据库即蛋白质组信息学),仍然是目前分析组份复杂蛋白质组重叠群(proteomiccontig)来提高分辨率,即蛋白质分辨率最高的工具,因此日益受到人们的广利用多块不同pH梯度和/或分子量上相互重叠的双泛关注。向电泳图谱,拼接成一张完整的双向电泳图谱。但1 双向电泳的基本原理因细胞内含有3～5万种蛋白质,远远不能满足需首先根据蛋白质等电点不同在pH梯度胶中等要。尽管在膜蛋白制备和双向电泳pH梯度范围扩电聚焦(isoelectricfocusing,IEF)将其分离,然后按照[4～6]展上有了较大改进,应用极窄pH梯度胶分离蛋它
4、们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二[7]白质组已有报道,但对细胞内的低拷贝蛋白、极端烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PAGE)第二酸性或碱性蛋白、分子量过大或过小蛋白、难溶蛋白次分离。(包括膜蛋白)等的电泳分离和检测仍面临很大困根据第一向等电聚焦条件的不同,可将22DE分难。要真正解决此问题还需进一步研究。为三种系统:第一种系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进2.2 可重复性 为提高22DE凝胶的重复性,引行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度,该系统[8]入了固定的载体两性电解质Immobiline,可是由称为ISO2DALT。
5、其主要缺点是pH梯度不稳定,重Immobiline222DE凝胶难以获得同等的重复性数据,复性差,上样量低,不利于不同实验室间进行图谱比[10]实验表明,虽然其蛋白质点相对位置有较好的重较;如果第一向电泳使用丙烯酰胺和Immobilines共复性,但其蛋白质点数最多可相差500多点。通过聚,形成具有pH梯度的凝胶,这种系统称为IPG2简化程序可以提高重复性,例如省去浓缩胶,在第二DALT系统,该系统pH梯度稳定,不依赖于外加电向电泳中使用连续的分离胶等。在得到高质量的可场,基本上克服了ISO2DALT的主要缺点,无论是重重复的电泳图谱中,
6、实践经验也是非常重要的。对[10,11]复性和上样量均优于ISO2DALT;第三种是非平衡pH整个22DE过程的自动化已经做了初步尝试。梯度电泳(nonequilibriumpHgradientelectrophoresis,2.3 染色 常用蛋白质点的染色方法有银染、荧NEPhGE),主要用于分离碱性蛋白质,电泳展开时间光染料、氨基黑、印度墨等。银染法灵敏度高,可以相对比较短。在蛋白质中找到含量较低的蛋白,且所需的上样量2 双向电泳的技术特点及存在的问题较少(每点仅需0.1ng)。但银染法也有许多缺点,2.1 分辨率 双向电泳分辨率
7、高。自Smithies如一些条带的可重复性差,动力学范围较小,一些普[1]等第一次应用22DE分离蛋白质以来,这种技术的通的蛋白质染色较差甚至根本没有,并且银染法很分辨率已从15个蛋白质点发展到10000个蛋白质费人力,对以后的质谱测定也有干扰。与此相比,荧①收稿日期:2001203219 修回日期:2001211204作者简介:刘上峰(19712),男,广东广州市人,中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室博士,从事遗传病的基因诊断、分子克隆等方面的研究。197 第2期国外医学·生理、病理科学与临床分册
8、第22卷 光染色虽然灵敏度稍低但具有较高的重复性,且容黑度等参数。根据标准蛋白(也可用内标,即蛋白质易完成。组内的成员),得到每个蛋白斑点的等电点和相对分3 应用子量,这就可建立数据库。随着需
