《双向电泳技术》PPT课件

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1、第三章双向电泳技术1*1809年俄国物理学家Peйce首次发现电泳现象。*1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。*1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。*1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离

2、进行过研究。*从上世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。*1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。*由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。*双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli蛋白。2一、电泳的基本原理1、在

3、电场作用下，带电颗粒向着与其电性相反的方向移动的现象称为电泳（electrophoresis)。由F=Eq，f=6πrυη可得υ=Eq/(6πrη)2、带电颗粒的泳动速度同电场强度和分子本身所带的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质黏度成反比。蛋白质是一种两性电解质。其泳动速度取决于蛋白质分子所带电荷的性质、数量以及颗粒的大小和形状。第一节蛋白质电泳的基本原理3在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷(种类和数量)、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。4二、

4、影响电泳速度的因素1、电场强度；2、缓冲溶液的pH；3、缓冲溶液的离子强度；4、电渗；5、焦耳热三、电泳的分类按原理分类：自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。稳态电泳（或称置换电泳）：分子颗粒的电泳迁移在一定时间达到一个稳态后，带的宽度不随时间而变化。区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。56?按支持介质种类的不同，

5、区带电泳可分为①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。?以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。7③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对

6、大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。8?另外根据支持介质形状不同，区带电泳可分为：薄层电泳、板电泳、柱电泳。?根据用途不同，可分为：分析电泳、制备电泳、定量电泳、免疫电泳。按pH的连续性不同，可分为：连续pH电泳，不连续pH电泳。9四、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定

7、量及少量的制备，还可测定分子量、等电点等。101、丙烯酰胺凝胶有以下优点：①几乎无电渗作用。②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH和温度变化较稳定。•在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，机械性能好，易观察。•凝胶孔径可调。•分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。112、聚丙烯酰胺凝胶的聚合12催化剂和加速剂的种类①AP-TEMED：化学聚合作用。加速剂四甲基乙二胺(TEMED)的碱基可使催化剂过硫酸铵(简称AP)的水溶液产生出游离氧原子，然后激活