鞘糖脂组学方法研究肝癌特征性鞘糖脂

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1、硕士学位论文论文题目鞘糖脂组学方法研究肝癌特征性鞘糖脂朱健研究生姓名李云森指导教师姓名免疫学专业名称肿瘤糖免疫研究方向2013年4月论文提交日期鞘糖脂组学方法研究肝癌特征性鞘糖脂中文摘要中文摘要第一章肝细胞肝癌实体瘤及相应癌旁组织中的鞘糖脂表达的质谱表征目的：运用糖组学方法研究肝细胞肝癌患者实体瘤样本中的鞘糖脂表达情况，对比同一个体来源的癌旁组织，找出明显差异表达的鞘糖脂结构，从而找出肝细胞肝癌相关的特征性鞘糖脂为肝细胞肝癌诊断、治疗等提供新的靶点，并为异常的鞘糖脂在肝细胞肝癌的生物学行为中所发生的作用提供初步的结构基础。方法：(1)采

2、用有机试剂溶液超声波组合式提取的技术从肝细胞肝癌的实体瘤样本中提取出总脂质；(2)利用DEAE-SephedexA25层析法分离纯化出酸中性鞘糖脂；(2)将所得的脂质用乙酰化修饰并用硅酸镁柱层析的方法去除其中的磷脂类进一步纯化鞘糖脂；(4)HPTLC的方法初步分析从肝癌和癌旁组织中提取出来的鞘糖脂；(5)完全甲基化方法修饰所分离纯化的鞘糖脂，并经由LTQ-ESIMS质谱技术进行初步分析；(6)ROC曲线法分析质谱数据中异常的鞘糖脂。结果：(1)同一个体来源的肝癌和癌旁初级总离子流谱图显示出在肝癌中的m/z1600到m/z2000范围内出

3、现的一群异常表达的鞘糖脂结构；(2)2级质谱分析研究的结果显示有三组异常的鞘糖脂本别是m/z1086，m/z1260，m/z1290，这三组异常的鞘糖脂均为被岩藻糖基化所修饰，并发现这三组异常鞘糖脂在肝癌组织中的表达水平显著高于相应癌旁组织中的表达水平；(3)通过SPSS软件的ROC曲线法（受试者特征工作曲线）分析32对肝细胞肝癌患者的肝瘤组织以及相应的癌旁组织质谱总离子流图数据发现m/z1086的AUC（曲线下面积）值是0.809，m/z1260的AUC值是0.722，m/z1290的AUC值为0.953.结论：肝细胞肝癌患者的实体瘤

4、样本中鞘糖脂的表达区别于同一个体来源的癌缘组织，其中在初级质谱数据上可见明显的一系列鞘糖脂的异常表达，这些明显异常表达的鞘糖脂经初步的结构定性发现均为岩藻糖基化修饰的鞘糖脂结构，受试者特征曲线说明一群三组岩藻糖基化的鞘糖脂其作为诊断靶点具有诊断效力，说明异常的岩藻糖基化鞘糖脂作为治疗诊断治疗靶点的潜在价值。关键词：鞘糖脂组学；岩藻糖基化；肝细胞肝癌；鞘糖脂；糖组学I第二章肝细胞肝癌中异常岩藻糖基化鞘糖脂的定性分析及其作为潜在靶点的结构基础目的：通过质谱准确定性异常的岩藻糖基化的鞘糖脂所有的结构，并找出其中可以作为诊断治疗靶点的的可能结构

5、基础。方法：(1)利用多级质谱方法结合相关的鞘糖脂标准品进行精确的异常鞘糖脂结构的表征；(2)ChemDraw等结构分析软件的结合多级质谱法结合定性；(3)多级质谱检测肝癌细胞系的异常岩藻糖基化鞘糖脂表达情况；(4)多级质谱检测肝癌病患血清中异常岩藻糖基化鞘糖脂表达情况(5)采用Real-TimePCR技术检测肝癌组织中相关岩藻糖基转移酶的表达情况。结果：(1)多级质谱对异常岩藻糖基化的鞘糖脂表征揭示其中含有TypeⅠ/ⅡHantigen，Lewisx，Lewisy，Lewisa，Lewisb，GloboH等结构，其中岩藻糖基化五糖m/

6、z1086中主要成分为TypeHantigen，双岩藻糖基化六糖m/z1260含有Lewisb与Lewisy，岩藻糖基化六糖m/z1290是GloboH；(2)三种肝癌细胞系中发现了和肝癌组织中类似的结果，均含异常糖基化鞘糖脂结构，如GloboH；(3)肝癌患者血清鞘糖脂的质谱表征发现有与肝细胞肝癌肿瘤组织相似的结果；(4)以糖组学的视角来分析结果发现，这些异常的岩藻糖基化鞘糖脂均含有相同的末端Fucɑ1-2Gal-结构域，其质谱表征图与Fucɑ1-2Gal的标准品的质谱表征图高度匹配，从而证实了我们的结果；(4)岩藻糖基转移酶FUT1

7、和FUT2的检测结果表明在不同的肝癌个体样本中其表达情况是不同的，揭示FUT1和FUT2在不同肝癌病人中其负责Fucɑ1-2Gal-的合成能力会有差异。结论：肝癌样本中异常表达的岩藻糖基化结构含有Hantigen，GloboH等多种的异常岩藻糖基化结构，揭示肝癌样本中鞘糖脂的异常岩藻糖基化是复杂多变的，然而糖链组成的特点让我们能够从糖链本身的结构入手，找到异常岩藻糖基化鞘糖脂的共有的糖链结构域，以此作为具有潜在价值的靶点，并且在本课题中我们发现这些复杂的岩藻糖基化鞘糖脂均具有末端Fucɑ1-2Gal-结构域，ROC分析发现其AUC值为0

8、.864，这些结果表明该末端结构域可以作为具有潜在诊断治疗价值的结构基础，肝癌病人血清以及肝癌细胞系的结果也证实了该结果。II鞘糖脂组学方法研究肝癌特征性鞘糖脂中文摘要关键词：血清；GloboH；岩藻糖基转