bmnpv侵染状态下及蜕皮前后家蚕幼虫血淋巴的蛋白质组学分析

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1、论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得江苏科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：日期：学位论文使用授权声明江苏科技大学有权保存本人所送交的学位论文的复印件和电子文稿，可以将学位论文的全部或部分上网公布，有权向国家有关部门或机构送交并授权其保存、上网公布本学位论文

2、的复印件或电子文稿。本人电子文稿的内容和纸质论文的内容一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅。研究生签名：导师签名：日期：日期：第一章绪论第一章绪论1.1蛋白质组学研究进展蛋白质组（Proteome）是由澳大利亚学者Wilkins和Williams于1994年首次提出的 [1]，指的是某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质。蛋白质组学（Proteomics）就是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象的学科。尽管到现在有很多模式生物的基因组序列已经完成，但有一半以上的基因还是未知的，目前功能基因

3、组的基因芯片和表达序列标签等技术都是以mRNA为研究对象的，其前提是细胞中的 mRNA水平反映了蛋白质的表达水平，实际上从mRNA到功能蛋白还要经过翻译调控、翻译后调控以及蛋白质的修饰等过程，所以在真核生物尤其是人体内的蛋白质种类远远多于mRNA的种类，而且蛋白质的修饰、定位和蛋白质之间的相互作用等信息是不 能通过mRNA的研究获取的，所以研究生命过程最终还要依赖于对蛋白质的研究[2-4]。目前对蛋白质大规模分离和鉴定的技术主要是双向电泳技术和生物质谱技术。1.1.1蛋白质组学的研究意义随着大量生物基因组序列的完成，科学家

4、们也逐渐认识到仅仅拥有基因组的完整序列还不足于阐明生物的生老病死等奥秘。细胞的生存需要多种水平的代谢和调节通路，在基因和功能蛋白之间也没有严格的线性关系，蛋白质才是生命的具体执行者，所以蛋白质组学是基因组学的重要补充[5]。实验证明基因组中ORF（openreadingframe）的存在并不代表功能基因的存在，尽管生物信息学技术的发展越来越快，但从基因组数据中预测基因还是很困难的。通过比较基因组学可以进行一些基因的预测，但一级结构正确预测的成功率还很低[6，7]。尤其在小基因和没有其它同源基因时更是如此。最近在支原体（My

5、coplasmagenitalium）的340个基因的注释中其错误率就达到了8%[8-10]。如果这样的错误率也在人类基因的注释中存在，那么错误注释的基因数将是惊人的。因此用蛋白质组学的方法对基因的产物进行确认是基因组注释的第一步。同源异形体和转录后修饰等现象不能通过核酸的序列获知，而必须通过蛋白质组学的方法才能证实。因为mRNA的水平和蛋白质之间没有严格的关系，所以蛋白质的表达水平也要用蛋白质组学的方法才能获悉[11，12]。基因产物的定位也不能通过核酸序列进行预测，也只能通过实验进行确认。而且蛋白质间的相互作用以及细胞

6、机构的分子构成也必须在蛋白质水平上才能弄清楚。1.1.2蛋白质组学的主要研究方法蛋白质组学的发展既是技术所推动的，也受到技术的限制。蛋白质组学研究成功1第一章绪论与否，很大程度上取决于其技术方法水平的高低。蛋白质研究技术远比基因技术复杂和困难。发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究的主要任务。当前国际蛋白质组研究主要还是以双向电泳进行蛋白质的分离和以生物质谱进行蛋白质鉴定为主的，该平台主要包括蛋白质样品的制备、双向电泳、图谱的软件分析和蛋白质的鉴定等。1.1样品的制备为了充分利用

7、双向电泳高分辨能力的优势,样品中的蛋白质必须被完全变性、解聚、还原和溶解，彻底破坏分子间的相互作用，确保每一个点代表一种多肽[13]。对细胞或组织中的蛋白质进行完全分离的难点在于蛋白质间丰度相差过大、分子量和溶解度间的差异等问题。虽然希望用一步法进行蛋白质的抽提，但是到目前还没有一种方法适合所有的样品制备。一些共同的原则被推荐：样品制备应尽可能简单以增加重复性，尽量降低蛋白质的修饰，尤其注意样品中的蛋白酶要失活，包含尿素的样品不能被加热[14]。样品制备的三个基本步骤是：细胞的破碎，干扰物质的去除和蛋白质的溶解。样品的破碎

8、一般用液氮研磨、超声破碎和匀浆等方法，然后再选用合适裂解液进行溶解。1.2双向电泳技术O’Farrell[15]在1975年发表了他发展的对蛋白质进行高效分离的双向电泳技术，该技术的原理是在第一向的等电聚焦电泳中根据蛋白质间的等电点的不同进行初步分离，然后在第二向的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中根据蛋白质