耐多药结核分枝杆菌耐药相关基因的分子流行病学研究

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1、硕士学位论文学校代码：10023学号：$2010035007耐多药结核分枝杆菌耐药相关基因的分子流行病学研究所院：姓名：指导教师：导师小组：学科专业：研究方向：完成日期：中国医学科学院北京协和医学院病原生物学研究所甄伟朱国峰副研究员朱国峰赵振东刘海鹰病原生物学结核分枝杆菌耐药性2013年6月目录㈣4㈣05㈣2㈣6Y23中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．3弓I言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．5实验材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1l一、实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1l1．实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l2．实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．1l3．溶液配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1l4．培养基配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12二、实验方法⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．20第一部分耐多药结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药基因embB突变研究⋯⋯⋯⋯．201．耐多药菌株和药物敏感菌株(对照)样本的组成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．202．耐多药菌株的药敏实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．203．耐多药菌株的北京型月E北京型(Rm05)基因分型结果⋯⋯⋯⋯．．344．耐多药菌株中北京型／非北京型与乙胺丁醇耐药性关系⋯⋯⋯⋯⋯355．耐多药菌株的乙胺丁醇耐药相关基因emb

4、B基因的突变结果⋯⋯．．36第二部分耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG突变研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯461．耐多药菌株和药物敏感菌株(对照)样本的组成⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．462．异烟肼耐药菌株和敏感菌株katG基因突变概况⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯463．异烟肼耐药菌株妇fG基因突变类型和频率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49全文总结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．56参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

5、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．57发表文章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．62致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯63独创性声明⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．“中圉医学科学院北京协和医学院硕士学位论文中文摘要耐多药(Multi．drugResistant，MDR)结核菌是指结核菌至少同时对利福平(Rifampicin，PiE)和异烟肼(Isoniazid，INH)两种一线抗结核药物发生耐药。我国耐多药结核病

6、患者比例很高，约为9．3％，是世界平均水平的2倍左右。耐多药结核病相比较于普通结核病防控难度高、治疗难度大、治愈率低且药物副作用大。耐多药结核病的防治最关键的是如何在早期快速、准确的诊断出结核菌的耐药性。基于固体培养基培养的传统药敏实验方法虽具有较高的准确性，但需较长时间，一般1—2月，患者可能因此耽误最佳的治疗时机；近年来新发展的基于液体培养基培养的药敏实验方法虽需时间较短，但由于其依赖于昂贵的仪器，因此使适用地区受到限制；分子生物学技术的迅猛发展，市场上出现了一批结核菌耐药性的快速诊断工具，这些工具的应用使

7、得简便且快速检测出结核菌的耐药性成为可能。由于不同地区流行菌株的主要突变类型和突变频率不同，这些产品在不同的地区使用时的灵敏度不同，因此在某些地区会出现灵敏度较低的缺陷。本研究的目的是，研究中国不同地区结核分枝杆菌耐药相关基因的优势突变位点和突变频率，有利于适用于不同地区的分子生物学诊断产品的开发，能够快速、准确的预测结核菌的耐药性。本研究分为两部分，第一部分为从北京、上海和广西三个地区共收集约380株耐多药结核分枝杆菌，药敏实验获得各菌株对四种一线药物的耐药结果，并且提取基因组DNA，对三地区MDR菌株基因组

8、DNA样本进行乙胺丁醇耐药相关基因embB扩增并测序以及北京型月E北京型(Rm05，DTM．PCR)基因分型；第二部分为对上海地区MDR菌株基因组DNA样本进行异烟肼耐药相关基因勋酊基因编码区全长扩增并测序，获得砌酊基因的突变特征。本研究发现，第一部分中：(1)北京型菌株是耐多药结核分枝杆菌的主要流行株；北京型和非北京型菌株的比例存在地域分布上的差异；(2)不同地区MDR菌株的embB