草莓镶脉病毒编码蛋白对其启动子的调节作用及其亚启动子鉴定

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1、ADissertationfortheDegreeofMasterRegulationofproteinsencodedbyStrawberryveinbandingvirustoitspromoterandtheidentificationofitssub-promoterByYangYouzhiSupervisedbyAssociateProf.JiangTongAnhuiAgriculturalUniversityHefei230036，P.R.ChinaJune，2013摘要草莓镶脉病毒（Strawberryveinbandingvirus，SVBV）属于花椰菜花叶病毒

2、科（Caulimoviridae）花椰菜花叶病毒属（Caulimovirus），SVBV为环状双链DNA病毒，基因组结构与花椰菜花叶病毒（CaMV）相似，包含7个ORF，也含有2个启动子。SVBV全长启动子P1位于ORFVI基因下游，与CaMV35S启动子的位置相同，驱动ORFI、ORFII、ORFIII、ORFIV和ORFV基因的转录；ORFVI基因的转录由一个独立的启动子sP驱动，类似于CaMV的19S启动子。本研究进一步分析了SVBV2个启动子的驱动活性、驱动外源基因在植物中的表达模式以及驱动外源基因表达的稳定性。另外，本研究还分析了SVBVORFI、ORFII、ORFI

3、II、ORFIV和ORFV基因编码的蛋白对全长启动子P1的调节作用。1SVBV各启动子驱动gus基因瞬间表达的组织化学染色将pINTP1、pINTP2、pINTP3、pINTP4、pINTP5和pINT121各表达载体电击转化的农杆菌分别注射本氏烟茎杆，组织化学染色并制备石蜡切片。显微观察发现，维管组织和部分皮层组织均能观察到蓝色位点，说明各启动子均能驱动gus基因在植物细胞中表达。2SVBV各启动子驱动gfp基因的瞬间表达和荧光活性观察将SVBVP1、SVBVP2、SVBVP3、SVBVP4和SVBVP5各启动子分别与载体pCHF3gfp基因前的35S启动子置换，获得植物表达

4、载体pCHFP1、pCHFP2、pCHFP3、pCHFP4和pCHFP5，电击转化农杆菌，菌液分别注射本氏烟茎杆，制备茎杆注射区徒手切片。荧光显微镜观察发现，各植株维管组织均能观察到绿色荧光，说明各启动子均能驱动gfp基因在植物细胞中表达。从各切片的绿色荧光强度上来看，pCHFP1中gfp基因的表达水平要高于阳性对照pCHF3。注射未转化载体的农杆菌菌液，茎杆切片中几乎观察不到绿色荧光。3转基因普通烟gus基因mRNA的Real-timePCR检测Real-timePCR检测pINTP1和pINT121转基因普通烟gus基因的mRNA积累量，结果表明，pINTP1和pINT12

5、1转基因普通烟gus基因的mRNA积累量均显著高于非转基因普通烟，pINTP1转基因普通烟gus基因的mRNA积累量显著高于pINT121转基因普通烟，说明SVBVP1启动子的驱动活性很高，且超出35S启动子的驱动活性。4SVBV各ORF表达载体的构建及其对全长启动子P1调节作用I构建SVBV中国分离物各ORF植物表达载体pBIN-ORFI、pBIN-ORFII、pBIN-ORFIII、pBIN-ORFIV、pBIN-ORFV和pBIN-ORFVI，电击转化农杆菌，将含有各表达载体的农杆菌分别和含有表达载体pINTP1的农杆菌等量混合，瞬间浸润本氏烟叶片，荧光光度法定量分析gu

6、s表达活性，结果显示pBIN-ORFII和pBIN-ORFV分别与pINTP1共浸润时gus蛋白酶活性均显著高于pINTP1单独浸润，pBIN-ORFIV与pINTP1共浸润时gus蛋白酶活性显著低于pINTP1单独浸润，pBIN-ORFI、pBIN-ORFIII、pBIN-ORFVI分别与pINTP1共浸润时gus蛋白酶活性与pINTP1单独浸润均无显著差异。结果表明，ORFII和ORFORFV编码蛋白均能提高P1启动子的驱动活性，ORFI、ORFIII、ORFVI编码蛋白对P1启动子驱动活性没有影响，ORFIV编码蛋白降低P1启动子的驱动活性。5SVBV亚启动子初步鉴定克隆

7、SVBV中国分离物和美国分离物的亚启动子sP-cn和sP-us，分别置换pINT121载体gus基因上游的35S启动子，获得植物表达载体pINTsP-cn和pINTsP-us，电击转化农杆菌，瞬间浸润本氏烟叶片，荧光光度法测定结果表明，pINTsP-cn和pINTsP-us的平均相对gus活性极低，与未注射本氏烟相比没有显著差异，说明这2个亚启动子基本没有驱动活性。关键词：草莓镶脉病毒；SVBV启动子；病毒编码蛋白；调节作用；SVBV亚启动子IIAbstractStrawberryveinb