结肠癌中丝苏氨酸磷酸化位点对cacybpsip核转位的影响

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1、分类号：R5单位代码：10752密级：公开学号：2010205宁夏医科大学硕士研究生学位论文结肠癌中丝/苏氨酸磷酸化位点对CacyBP/SIP核转位的影响TheImpactofCacyBP/SIPNuclearTranslocationonPhosphorylationofSerine/ThreonineSitesinColonCancer学位申请人：冯珊珊指导教师：翟惠虹副教授合作指导教师：张英鸽教授申请学位门类级别：医学专业名称：内科学研究方向：结肠癌的核转位机制所在学院：临床医学院论文完成日期：二○一三年四月宁夏医科大学研究生院NingxiaMedicalUni

2、versityThesisforApplicationofMaster’sDegreeTheImpactofCacyBP/SIPNuclearTranslocationonPhosphorylationofSerine/ThreonineSitesinColonCancerStudent’sName:FengShanshanSupervisor：ZhaiHuihongAssistantsupervisor:ZhangYinggeSubjectCategory:MedicineMajor:InternalMedicineSpecialty:Gastroenterolog

3、ySchool:ClinicalInstituteCompletionDate:Apr.2013宁夏医科大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日宁夏医科大学关于学位论文使用授权的声明宁夏医科大学有权保留使用本人学位论文，同意学校按

4、规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权宁夏医科大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名＿＿＿＿＿论文导师签名＿＿＿＿＿年月日年月日结肠癌中丝/苏氨酸磷酸化位点对CacyBP/SIP核转位的影响摘要目的：结肠癌发生机制目前还未明确，因此缺乏理想的治疗手段。钙周期素结合蛋2＋白(Calcyclin-bindingprotein，CacyBP/SIP)，是1998年发现的以Ca依赖

5、的方式作为S100蛋白家族的靶蛋白。结构分析提示：CacyBP/SIP具有核定位信号；具有潜在的PKC2＋磷酸化位点。功能研究表明：在结肠癌中，具有依赖Ca浓度的核转位及磷酸化现象，并促进癌细胞增殖。本实验通过构建CacyBP/SIP的丝/苏氨酸磷酸化位点的显性负性突变体，明确丝/苏氨酸磷酸化位点对CacyBP/SIP在结肠癌细胞内定位的影响，以图揭示CacyBP/SIP核转位的分子机制，进而从源头上抑制结肠癌细胞增殖，为在分子水平上治疗结肠癌提供实验依据。方法：首先，通过基因克隆及基因重组等基因工程方法构建pEGFP-N1-hCacyBP真核表达质粒。其次，通过磷酸

6、化激酶数据库网站预测hCacyBP蛋白潜在的丝/苏氨酸磷酸化位点，以pEGFP-N1-hCacyBP真核表达质粒为模板，采用PCR介导的定向突变方法，构建hCacyBP蛋白的丝/苏氨酸显性负性突变体。然后，将pEGFP-N1空载，pEGFP-N1-hCacyBP对照组质粒及其丝/苏氨酸磷酸化突变质粒分别通过脂质体介导方法瞬时转染入结肠癌SW480细胞中。最后，通过免疫荧光和激光共聚焦方法，观察hCacyBP及其丝/苏氨酸显性负性突变体在结肠癌细胞内的定位表达。结果：1.成功构建了pEGFP-N1-hCacyBP真核表达质粒。2.通过磷酸化激酶数据库网站具体预测并筛选了

7、9个hCacyBP蛋白的潜在丝/苏氨酸磷酸化位点。3.以pEGFP-N1-hCacyBP真核表达质粒为模板，进一步成功构建了hCacyBP蛋白的9个丝/苏氨酸磷酸化显性负性突变体，分别为S3A，S34A，S48A，S137A，S141A，S142A，S180A，S188A，S217A。4.将pEGFP-N1空载，pEGFP-N1-hCacyBP对照组，及S3A，S34A，S48A，S137A，S141A，S142A，S180A，S188A，S217A这9组突变体分别转染入SW480细胞内，发现：pEGFP-N1定位于细胞核；pEGFP-N1-hCac