pcr技术及实用方法_郑景生[1]

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1、分子植物育种,2003年,第1卷,第3期,第381)394页MolecularPlantBreeding,2003,Vol11,No13,381)394分子植物育种实验室方法(二)METHODSINLABOFMOLECULARPLANTBREEDING(2)PCR技术及实用方法1,21郑景生吕蓓1海南省农作物分子育种重点实验室,三亚,5720252福建省农业科学院稻麦研究所,福州,350019摘要本文系统介绍了PCR技术的原理,反应组分、反应程序及PCR产物的电泳检测方法。这些实用的PCR方法大都来源于国内外一些著名的实验

2、室并经海南省农作物分子育种重点实验室改进而成。这些方法作为分子植物育种实验室的技术平台具有非常好的实用性,能满足常规的分子生物学及生物工程技术研究的要求。关键词PCR技术,分子植物育种PCRTechniqueanditsPracticalMethods1,21ZhengJingshengLBei1HainanProvincialKeyLaboratoryofCropMolecularBreeding,Sanya,5720252TheInstituteofRice&wheat,FujianAcademyofAgricaltu

3、ralSciences,Fuzhou,350019ABSTRACTThispaperintroducedPCRprinciples,reactioncomponents,reactionprogramsandelectrophoresisdetectingtechniques1AllofthepracticalprotocolswerederivedfrommanyfamousdomesticandinternationallaboratoriesandmodifiedbyHainanProvincialKeyLabora

4、toryofCropMolecularBreeding(HiCMBL)1Ithasmorebeneficialtoadaptthoseprotocolsastechnologyplatforminthelabofmolecularplantbreedingduetoitsgoodpracticability,whichcouldmeetthedemandsoftheresearchesinfieldsofmolecularbiologyandbiotechnology1KEYWORDSPCR,Practicalmethod

5、,Molecularplantbreeding是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的某些1前言特点,实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增,可在短时间内在试管中获得数百万个特异PCR,聚合酶链式反应(PolymeraseChainDNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠,Reaction,PCR)是1985年由美国PE-Cetus公司并被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等的科学家KaryBanksMulis发明的一种可在体外快各个领域的基因研究和分析,对分子生物学的发速扩增特定基因或DNA序列的技术。这项新技术分

6、子植物育种382MolecularPlantBreeding展产生了革命性的影响。发明人KaryBanksMulisDNA也可用作PCR反应的模板。也因此荣获1994年度诺贝尔化学奖。212引物PCR技术的原理是:DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链DNA来启动合成,PCR引物是一段与待扩增的目标DNA序列侧通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链翼片段互补的寡核苷酸片段,长度大多为10-30DNA模板中的一段互补序列结合,形成部分双个碱基。通常,一对引物包含5.端与正义链互补链。在适宜的温度和环境下,DNA聚

7、合酶将脱氧的寡核苷酸片段和3.端与反义链互补的寡核苷酸单核苷酸加到引物3.-OH末端,并以此为起始片段,这两个寡核苷酸片段在模板DNA上的结合点,沿模板5.y3.方向延伸,合成一条新的DNA位置之间的距离决定PCR扩增片段的长度。互补链。PCR反应的基本成分包括:模板DNA根据统计学计算,长约17个碱基的寡核苷酸(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸序列在人类基因组中可能出现的概率为1次。因(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。此,只要引物不少于16个核苷酸,就能保证PCRPCR反应中,通过双链DNA的高温变性扩增序

8、列的特异性。引物过长往往会降低其与模(denaturation)、引物与模板的低温退火(annea-l板的杂交效率,从而减低PCR的反应效率。ing)和适温延伸(extension)这三步反应反复循PCR反应成功的关键是设计最佳的引物。引环。每一循环中所合成的新链,又都可作为下一物设计的先决条件是与引物