PCR技术及应用

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1、PCR技术及应用PCR:Polymerasechainreaction聚合酶链反应，亦称DNA的体外扩增技术。PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明

2、了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖本章要讲述的主要内容：一、PCR的基本原理二、PCR的体系组成三、PCR的实施四、PCR的结果分析及条件优化五、PCR的类型六、PCR的应用七、连接酶链反应八、RNA扩增一、PCR的基本原理－－－－－细胞DNA复制过程－－－－－D

3、NA变性与复性1、细胞DNA的复制以DNA的两条链为模板，以4×dNTP为原料，按照碱基互补配对的原则，合成子代DNA的过程。体内DNA的复制体系DNA聚合酶（IIIIII）拓扑异构酶解旋酶类SSB引物dNTPMg2+5’3’（1）体系组成模板DNA、DDDP、dNTP、SSB引物酶、连接酶、拓扑异构酶、解链酶（2）DNA复制的基本过程复制的起始复制的延伸复制的终止E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA

4、-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串联重复序列反向重复序列5353A.起始DnaADnaB、DnaCDNA拓扑异构酶引物酶SSB3535复制的起始含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物3'HO5'引物酶复制的起始复制过程简图目录B复制的延伸555RNA酶OHP5DNA-polⅠdNTP55PATPADP+Pi55DNA连接酶

5、C复制的终止复制的终止爬行模型目录DNA聚合酶复制子链进一步加工目录复制的终止2、DNA的变性与复性DNA变性：在某些理化因素作用下，维系DNA空间结构的次级键破坏，双螺旋解开成两条单链，DNA的理化性质与生物学功能改变的现象。变性DNA的复性：在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。PCR反应体系模板DNA(Template)Taq酶(TaqDNApolymerase)dNTP引物(Primers)（上游、下游）缓冲液体系(buffer)Mg2+二、PCR的体系组成三、PCR的实施实施流程：模

6、板获取引物设计体系建立PCR扩增结果鉴定体系优化1、模板的获取来源：病原体标本（Virus,bacteria,fungalcells）病理生理标本（Cells,blood,urine）类型：DNA模板RNA模板DNA提取：酚－氯仿法（组织、血液、培养细胞、质粒的提取方法有所不同）血液DNA提取：1．提取WBC（1）取2ml（EDTA抗凝）全血，加入等体积3%的明胶，用滴管抽吸混匀，37oC水浴静置5-10分钟。（2）取上清液，3500~4000r/min离心5分钟。（3）弃上清液，留沉淀。2．破碎WBC在留有沉淀的试管中加TES2m

7、l，溶解沉淀。加10%SDS10滴，吸管抽吸混匀，破膜。3．抽提DNA（1）加入2mlpH7.8的饱和酚，滴管抽吸混匀。3500~4000r/min转离心5分钟。（2）取上层水相至另一离心管，加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），滴管混匀，3500~4000r/min转离心5分钟。4．沉淀DNA将上层水相移至另一试管中，小心加入2.5倍体积的无水乙醇，用滴管吸上层乙醇沿管壁缓慢冲洗下层溶液（小心），看到DNA絮状沉淀完全析出为止。5．用吸管吸出絮状沉淀至另一离心管，70%乙醇洗涤2次，放置于冰箱挥干。将上述挥干的DNA加入200μl

8、TE（或者灭菌双蒸水），轻轻震荡，使之溶解。RNA提取：1）取肝脏组织100~200mg加入7ml离心管中，加PBS缓冲液或Hanks液1ml，高速匀浆。2）取上述匀浆200ul至一个1.5ml的离心管中，加TRIZOL500ul，震