亲和色谱用无色合成配基对胰蛋白酶纯化功能的研究

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1、研究报告亲和色谱用无色合成配基对胰蛋白酶纯化功能的研究改玉奎杨利高昆玉*程侣柏*邹汉法（中科院大连化学物理研究所国家色谱研究分析中心大连116011*（大连理工大学大连116012）提要考察了一种新型的阳离子无色三嗪化合物、几种阴离子无色三嗪化合物和三嗪染料作为亲和色谱配基对胰蛋白酶的吸附性能。猪胰蛋白酶经阳离子型配基一步纯化比活达到116U/mg纯化21.6倍回收率88%。关键词亲和色谱，无色三嗪配基，胰蛋白酶2.2实验方法1前言2.2.1配基的合成及固定化参照文献[4-6]在整个生物技术的研究和开发中，下游产品的2.2.2

2、酶和蛋白的检测胰蛋白酶和糜蛋白酶活分离与纯化占有十分重要的地位亲和色谱是分离性的检测参照文献[7]，蛋白质含量检测用考马斯亮纯化生物大分子的重要手段，由于其配基对生物大蓝法[8]，以牛血清白蛋白为标准分子可逆的特异性结合，纯化效果远优于其它方法，2.2.3粗酶液的制备将猪胰蛋白酶粗品500mg但所用配基大都是从特定组织中提取出来的价格昂（干粉）加入到平衡缓冲液中，于4℃下振荡3h，离心贵的生物小分子，如辅酶、抑制剂、抗体或抗原等染(4000r/min)1Omin上清液在4℃下对平衡缓冲液料配基亲和色谱是以活性染料为配基的纯化生

3、物大透析过夜透析过的酶溶液使用前需离心5min（由分子的分离技术，它比传统的生物配基亲和色谱具于材料的限制，考察配基吸附影响因素和柱色谱分有取材广泛、价格低廉、结合容量大、稳定性好、易与离时分别采用了牛胰蛋白酶和猪胰蛋白酶）载体偶联、适用范围广、通用性好等优点[因此，染2.2.4染料及无色配基对胰蛋白酶的初分离染料配基已成为亲和色谱纯化生物大分子的重要组成部分通过研究系列蒽醌染料与蛋白质相互作用的料或无色配基吸附介质（0.5g湿凝胶）悬浮于装有2mLO.lmol醋酸盐缓冲溶液[含46U胰蛋白酶，机制发现，染料分子中的蒽醌ɑ环并

4、非必要的功能基团，而与三榛环连接的尾基结构（氨基苯磺酸异构体0.02molLCaCl2和0.05mol/LNaC1,pH4.0（阴离等）和桥基结构（苯二氨类异构体）对蛋白的吸附容子配基）或pH5.5（阳离子配基）]的试管中，室温量及选择性有显著影响[2为此，我们设计并合成了下，试管在振荡器中缓慢振荡30min，凝胶自然沉降六个不带蔑醌环的均三嗪无色配基，实验结果表明，后，检测上清液中的酶活性及蛋白含量用平衡缓冲它们对小牛肠碱性磷酸单酯酶的分离纯化效果比液洗掉未吸附的酶，然后用lmol/LKC1解吸结合CibacronBlueF

5、3GA还好3,4]本文在此基础上将合酶，再测上清液中的酶活性及蛋白含量成的带有阴、阳离子基团的无色三嗪化合物及染料2.2.5染料及无色配基对猪胰蛋白酶的柱色谱分作为亲和色谱配基，研究了对胰蛋白酶的纯化离过程将经透析的胰蛋白酶粗酶萃取液（5mL，含114U胰蛋白酶、312U糜蛋白酶，胰蛋白酶比活为2材料和方法5.3U/mg）加到用0.lmol/L醋酸盐缓冲液（对于阴2.1材料离子配基，pH4.0；对于阳离子配基，pH5.5）预平衡牛胰蛋白酶、SepharoseCL-4B和考马斯亮蓝的色谱柱（1.1cmi.d.8cm,5.5g湿凝

6、胶）上，用G-250分别购自Sigma公司、Pharmacia公司、Fluka55mL平衡缓冲液洗脱未吸附的杂蛋白，然后对于公司；猪胰蛋白酶粗品由大连理工大学生化工程实阳离子配基凝胶柱用含lmol/LKC1的上述平衡缓验室提供，作为参照的染料配基是本实验室合成的；冲液再淋洗阴离子配基吸附的胰蛋白酶用0～其它试剂均为国产分析纯试剂lmol/LKC1(pH4.0)线性梯度洗脱，阳离子配基吸本文收稿日期:1996年1月24日附的胰蛋白酶用50mmol/L(55mL)甘氨酸-盐酸缓料用于亲和色谱分离纯化蛋白质和酶[9，这些化合冲液(p

7、H2.1)洗脱分别检测收集液(5.5mL/管，流物都是有颜色的，而且大多数都带有多个磺酸基或速24mL/h)的酶活性及蛋白含量其它阴离子基团然而本文报道的4个完全对称的含有两个一氯均三嗪环的生物模拟物是无色的图3结果和讨论1给出了4个无色配基（1种阳离子和3种阴离子）迄今为止，已有许多商品染料和设计合成的染和作为参照的3个染料配基的化学结构式所有的无色配基都很容易通过一氯均三嗪活性基与交联琼酯糖CL-4B偶联，为了比较各种配基的纯化功能，将浓度都控制在每克湿凝胶含2.5～3.5mol配基的范围胰蛋白酶具有抗肿清炎、化痰去瘀及与

8、抗癌药物、抗菌素合用可增强药效等医疗作用由于它与糜蛋白酶具有相似的一级结构和几何空间构型，用一般的方法很难将二者彻底分离，因此，研究胰蛋白酶与糜蛋白酶的分离提纯方法具有现实意义3.1影响色谱介质吸附效果的物化因素酶液的初始浓度、缓冲液的pH值、离子强度和温度是影响介质对酶吸附