盐酸普鲁卡因对胰腺癌panc-1细胞增殖的影响及其作用机制

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1、分类号R6密级公开UDC硕士学位论文盐酸普鲁卡因对胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响及其作用机制学位申请人：吴志信学科专业：外科学指导教师：朱耀明二○一三年五月ADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineInfluenceandMechanismofProcainehydrochlorideonhumanpancreaticcancerPANC-1cellsGraduateStudent:WuzhixinMajor:SurgerySup

2、ervisor:Prof.ZhuyaomingChinaThreeGorgesUniversityYichang,443002,P.R.ChinaMay,2013三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学

3、习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：I三峡大学硕士学位论文内容摘要目的：至今胰腺癌确切病因不明，可能与吸烟、饮酒、咖啡、高蛋白饮食、环境、职业、家族和遗传因素等相关。伴随着分子生物学的发展，纵观国内外研

4、究关于胰腺癌发病机制的探讨很多，多数从分子基因水平进行，其发生发展与其他肿瘤一样可能涉及癌基因激活、抑癌基因失活和基因错配修复。表观遗传学成为近年研究的热点，特别是抑癌基因启动子的高甲基化与去乙酰化使抑癌基因表达沉默失去抑癌作用，成为胰腺恶性肿瘤发生及转移的一种机制，揭示了部分胰腺癌发生发展的原因，异常表观遗传学改变征像为早期血清学或是外分泌液检测和早期诊断治疗提供理论依据，同时拟寻找新的早期胰腺癌特异肿瘤标志物。本实验将探讨盐酸普鲁卡因(procaine，PCA)对人胰腺癌PANC-1细胞增殖的影响，分析药物处理前后肿瘤坏死因子受体超家族成员10C（TNFRSF1

5、0C）mRNA表达的变化，并探讨盐酸普鲁卡因抑制人胰腺癌PANC-1细胞增殖的分子机制，以期为胰腺癌的发病机制及治疗提供新的思路并找到新的理论依据。方法：(1)体外培养人胰腺癌PANC-1细胞，四甲基偶氮唑盐比色法观察24小时、48小时、72小时及96小时细胞生长及抑制情况；分别以5mmol/LPCA处理24h，10mmol/LPCA处理24h，10mmol/LPCA处理48h，观察细胞形态学改变；流式细胞仪检测细胞生长周期改变；构建体外甲基化DNA（IVD）和非甲基化（NL）的阳性对照，采用甲基化特异性聚合酶链反应(Methylation-specificPCR,

6、MSP)检测人胰腺癌PANC-1细胞中TNFRSF10C基因甲基化状况；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹技术（WesternBlotting）检测人胰腺癌PANC-1细胞内TNFRSF10C基因mRNA及蛋白表达情况。(2)用PCA和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-relatedapoptosisinducingligand,TRAIL）单独及联合处理PANC-1细胞，观察细胞的增殖变化，检测TNFRSF10CmRNA在用药前后表达有否改变，用甲基化特异性PCR法(Msp法)检测胰腺癌PANC-1细胞TNFRSF10C基因启动子甲基化状态。结果：

7、(1)倒置显微镜观察发现被PCA处理后的人胰腺癌PANC-1细胞呈现体积缩小、融为空泡、并且漂浮于培养基中等增殖抑制及死亡的形态学特征；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）结果分析表明PCA能显著抑制PANC-1细胞分裂增殖，其抑制率随着药物浓度的升高而增强；随着时间的延长抑制率亦增强；FCM结果证实PCA可以使PANC-1细胞的G2/M期细胞所占比例明显升高，而s期细胞所占比例显著性下降，PCA可使PANC-1细胞生长阻滞在G2/M期。(2)甲基化特异性PCR显示PANC-1细胞TNFRSF10C基因启动子CpG岛存在甲基化状态的异常表观学现象，逆转录PCR显示在人