基于cas9基因修饰技术构建epcam调控糖脂代谢小鼠模型及鉴定

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1、广东药科大学硕士研究生学位论文分类号：___________密级:___________UDC:___________基于Cas9基因修饰技术构建EpCAM调控糖脂代谢小鼠模型及鉴定姓名：黄丽学号：2111548006院系：中药学院学位类型：学术学位专业：中药学研究方向：中药及复方药理和毒理的研究导师：郭姣教授论文提交日期：年月日论文答辩日期：年月日学位授予单位：广东药科大学二〇一八年五月广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文GenerationandIdentificatio

2、nofEpCAM-regulatedGlycolipidmetabolicmousemodelbasedonCas9genemodificationtechnologyCandidate：LiHuangStudentID：2111548006Affiliation：SchooloftheTraditionalChineseMedicineAcademicDegreeApliedfor：MasterofMedicineSpeciality：TraditionalChineseMedicineSuper

3、visor：Prof.JiaoGuoDayofDefence：May,2018Degree-Conferring-Institution：GuangdongPharmaceuticalUniversityMay,2018广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文学位论文知识产权归属声明本学位论文是郭姣教授主持的广东省科技厅国际合作项目“基于糖组学技术的组分中药调节糖脂代谢的机制研究”（2015A050502050）、广东省科技厅国际合作基地建设项目“代

4、谢病中西医结合防治国际合作基地建设”(2016B050501003)和雷自立副研究员主持的国家自然科学基金“EpCAM对肠上皮细胞间连接和细胞极性的调控机制研究”（31671520）的部分内容，本论文研究成果知识产权归郭姣教授所有。特此声明。广东药科大学硕士研究生学位论文广东药科大学硕士研究生学位论文基于Cas9基因修饰技术构建EpCAM调控糖脂代谢小鼠模型及鉴定摘要研究背景：糖脂代谢病是由糖代谢紊乱和脂代谢紊乱引起的一系列疾病的总称，肝脏是调节机体糖脂代谢的重要器官，目前大多数对糖脂代谢病的研究主

5、要在肝脏开展。从中医的角度来讲“肝”在机体生命活动中主要起“枢纽”平衡作用，能够协调其它脏腑功能的顺利进行。现代发育生物学研究发现肝脏与肠道是同源的，二者在调控代谢方面均有重要作用。中医药在治疗糖脂代谢紊乱有着多层次、多靶点的特点。上皮细胞连接分子EpCAM已被证实对胚胎干细胞多能性的维持具有重要意义，在肝脏干细胞等多种成体干细胞中发挥着重要作用，在小鼠胚胎期肝干细胞中高表达，在成熟的肝细胞中低表达或不表达，而且在由肝纤维化、肝硬化、肝癌等肝损伤引起的肝脏疾病的肝细胞中异常表达。当EpCAM缺失，人

6、和小鼠的肠道均发生先天性簇绒肠病；在前期研究中发现EpCAM打靶伴随小鼠肠道紧密连接结构改变，而这一改变会严重影响肠道功能，进而对肝功能I广东药科大学硕士研究生学位论文产生影响，但EpCAM对糖脂代谢的具体调控机制目前尚不清楚。CRISPR/Cas技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具，能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。运用最新基因编辑技术CRISPR/Cas9获得稳定遗传的EpCAM基因敲

7、除小鼠，对该基因敲除模型小鼠进行研究以探索EpCAM干预糖脂代谢病的功能，并在中医药理论指导下研究其机理。目的：1、运用CRISPR/Cas9技术，体外构建载体结合电转染注射、胚胎移植、小鼠传代等获得稳定遗传的EpCAM基因敲除小鼠。2、对制作出的EpCAM基因敲除小鼠的基因敲除效果进行验证。3、研究EpCAM基因缺失对肠道分化能力的影响，进而探讨对糖脂代谢的调控机制。方法：1、EpCAM基因敲除小鼠的制作：体外构建Cas9mRNA及gRNA载体，通过电转染注射与胚胎移植获得F0代小鼠并对其鉴定基因

8、型，选取杂合基因型小鼠与C57BL/6小鼠杂交得到F1代小鼠，鉴定其具体序列。选取敲除序列完全一致的雌雄鼠自交继而繁殖得到F2代小鼠，选取遗传性状稳定的杂合F2代小鼠进行繁育保种，并从中选取基因敲除纯合子小鼠进行分析。II广东药科大学硕士研究生学位论文2、EpCAM基因敲除小鼠打靶效果及表型检测：对EpCAM基因敲除小鼠做表型分析，肠道形态学和组织化学分析，随后对肠道紧密连接分子做Real-timePCR检测，并结合免疫组化检测分析。3、EpCAM基因敲除后小鼠肠细胞