烟草rapd反应体系优化及品种多态性标记研究

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1、万方数据中国烟草科学2004，(2)：9-13烟草RAPD反应体系优化及品种多态性标记研究常爱霞1，瞿永生2，贾兴华1(1．宰鲁≤端萼觜暑黼，ttt东．青州2625002．河南农业大学，河南郑州450002)摘要：利用鲜烟叶材料对RAPD反应体系进行了优化，建立了一个适合烟草的比较稳定的RAPD反应体系，并对影响RAPD反应的主要因素进行了探讨。利用该稳定体系，对具有两对相对性状差异的两个烤烟品种进行了多态性标记研究，从500个引物中筛选到4个有多态性的引物，这4个引物扩出的多态性片段可作为鉴定

2、两个品种的分子标记。初步分析认为，两个品种的多态性标记可能与香气性状和抗病性状连锁。关键词：烟草；RAPD；反应体系；品种；分子标记中图分类号：$572．035文献标识码：A文章编号：1007-5119(2004)02-0009—05遗传标记作为一种重要工具和手段，已在作物遗传育种中得到了广泛应用。但由于作物的～些遗传标记如形态标记、生化标记(同工酶、蛋白质电泳)、细胞标记(染色体分带)等数量有限，很难对作物基因组进行详细分析，在应用上受到了种种限制。近年来，DNA分子标记的出现，为基因组提供了

3、几乎无限的标记位点，基于PCR的一种DNA分子标记——RAPD标记，自5990年Williams和Welsh创立以来，以其快速有效、灵敏度高、操作简单安全、实验成本低等优点【11，已广泛地应用于生物多样性检测【酬、基因定位M、遗传作图[8-10l、QTL分析[11-13】、外源基因跟踪【14】、品种真实性鉴定【15】等领域。然而，RAPD技术采用的引物较短(通常为9或10核苷酸单链DNA分子)，退火温度较低(常低于45cc)，对反应条件比较敏感，应用RAPD标记时，对反应体系进行优化十分必要。关

4、于烟草m～PD反应体系，何川生等曾用干烟叶进行了体系优化【lq。但烟草性状的研究对象或供试材料主要为活体，试材大部分是鲜烟叶，为此，利用鲜烟叶材料对烟草RAPD反应体系进行了优化，建立了一个适合烟草的比较稳定的RAPD反应体系。利用该稳定体系，对具有两对相对性状差异的两个烤烟品种进行了多态性标记。从500个引物中筛选到4个有多态性的引物，4个引物扩出的多态性片段可作为鉴定两个品种的分子标记。1材料和方法1．1材料供试品种大白筋599，SpeightG一28。取供试品种旺长期顶部叶片为试材。1．2

5、基因组DNA的提取方法采用改良的SDS法。1．3体系优化试验设计PCR反应采用20斗L体系，模板DNA40ng，引物0．6／．rmol，dNTP125／LLmol，MgCl22mmol，TaqDNA聚合酶1U。在保持其它因素一致的条件下，变化单一因子，筛选最优参数。热循环程序为：94℃预变性6min，之后94℃变性1min，36cC退火40S，72℃延伸2min，反应进行40个循环，然后72℃延伸6min，最后4℃保存。2体系优化结果与分析试验所用模板DNA，除特别说明外，均为烤烟品种大白筋59

6、9、G-28。电泳结果除特别说明外，从a-X每4个泳道为1个体系，体系按试剂用量或浓度从小到大的顺序依次为a、b、C、d，O-,f、g、h，i^k、l，m、n、o、P，q、r、s、t，U、V、W、X，Y、g、队入，其中a,b、e、f、i、j、m、n、q、r、u、v、Y、z泳道为相同引物，C、d,g、h、k、l、o,p、s、t、W、x、斗、入泳道为相同引物；a、c、e、g、i、k、m、o、q、S、U、W、Y、斗泳道为相同模板，b．d、f、h永1,n、p,r、t、v、x、z、入泳道为相同模板；M为m

7、arker。2．1MgCl2浓度筛选设5．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5mmol6个M姬12终作者简介：常爱霞。女，(1975一)，河南许昌人，硕士，主要从事分子生物学与烟草育种研究。收稿日期：2004—01—069万方数据中国烟草科学图1MgCl2浓度筛选浓度梯度，引物为Y317、Y318(图1)。据电泳图谱，为避免MgCl：浓度过低影响聚合酶活性而过高造成非特异性扩增，MgCI：浓度选择2．0mmol最佳(i—1)。2．2模板DNA用量筛选设10、20、40、60、80、100n

8、g6个DNA用量梯度，引物为Y468、Y494(图2)。结果表明，DNA用量在10—100ng之间时，均有扩增产物。但DNA用量在40ng时(iLl)最理想。2．3dNTP浓度筛选改100、1257150720072507300、350txmol7爹dNTP终浓度梯度，引物为Y102、Y386(图3)。PCR结果表明。dNTP浓度在150—250lxmol之间时(i—t)，扩增产物带清晰明亮，为降低成本，dNrIP浓度在150I山mol时(i—1)较为理想。2．4随机引物浓度筛选设0．2、0．4