猪瘟病毒erns、ns4a、ns4b、ns5a蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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1、分类号UDCS855．3硕士学位论文猪瘟病毒Ems、NS4A、NS4B、NS5A蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备尹珊学科专业亟随兽医堂指导教师墨廷苤教援论文答辩日期2Q!三生§月2墨目学位授予日期答辩委员会主席陆左童塾援愀靴黼㈣愀㈣f㈣卿WIIIJlIIIII／本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归

2、属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。(请在以上相应方框内打“√")论文作者签名：命胡计指导撕签名：帆复作者联系电话：155784366b日期：2013年6月牛日日期劢I岁争6国中目电子邮箱：651309414@qq．com猪瘟病毒Em8、NS4A、NS4B和NS5A蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备摘要猪瘟分布于是世界各地，在国内广泛流行，给养猪业造成严

3、重的经济损失。长期的疫苗使用，造成病毒发生变异，呈现多种病型的发生。猪瘟病毒建立了一种逃避宿主先天性免疫系统识别的策略，免疫系统不能识别非自我元件而导致免疫耐受，造成猪的持续性感染。猪瘟病毒E傩蛋白能诱导产生中和抗体，在病毒的持续性感染和抗病毒应答过程中发挥重要功能作用，NS4A、NS4B、NS5A参与病毒RNA的复制过程，四种蛋白Em8、NS4A、NS4B和NS5A在对宿主的致病过程中扮演着重要角色，研制猪瘟病毒各种蛋白的抗体有助于对病毒蛋白的结构与功能的深入探讨，因此本研究通过制备结构蛋白E嬲和非结构蛋白NS4A、NS4B和NS5A的多克隆抗体，进一步探索感染细胞

4、中猪瘟病毒Em5、NS4A、NS4B、NS5A蛋白与宿主的相互作用关系。本文克隆了Em8、NS4A、NS4BA205—347、NS5A基因，将这些基因插入原核表达载体PET-32a(+)克隆位点，成功构建了PET-Em5、PET—NS4A、PET—NS4B△205—347、PET—NS5A重组原核表达质粒。将重组质粒转化BL一21或BL一21衍生菌并进行IPTG诱导表达，经SDS-PAGE和WestemBlot分析显示Em8、NS4A、NS4BA205～347和NS5A基因得到了有效表达，Em8、NS4A、NS5A重组蛋白主要以包涵体的形式表达，而NS4BA205-3

5、47重组蛋白能以包涵体和可溶性蛋白两种形式进行表达。E傩、NS4A、NS5A包涵体在变性条件下，通过Ni2+的亲和层析法纯化蛋白，纯化的蛋白经逐步透析法进行复性重折叠，获得有活性的免疫原。NS4BA205-347可溶性蛋白不需经变性就可经Ni2+的亲和层析纯化获得有活性的蛋白。以制备的Em8、NS4A、NS4BA205—347、NS5B重组活性蛋白作为抗原按免疫程序免疫四周龄小鼠，获取抗这四种蛋白的多克隆抗体。WesternBlot分析显示：抗Em8、NS4A、NS4BA205-347和NS5A重组蛋白的多克隆抗体能分别与相应的重组蛋白发生良好反应；PK一15细胞中真

6、核表达融合GFP蛋白的NS4B蛋白，抗NS4BA205-347的多克隆抗体能特异地识别NS4B—GFP融合蛋白；抗NS5A蛋白的多克隆抗体能与PK一15细胞真核表达的NS5A—GFP融合蛋白特异性结合；NS4A、NS5A多抗能分别特异性地检测到CSFV感染PK一15细胞中的NS4A、NS5A蛋白。对感染CSFV的PK一15细胞的间接免疫荧光抗体试验显示：抗Em3、NS4A、NS4BA205—347、NS5A重组蛋白的抗体能分别与CSFV的Em8、NS4A、NS4B、NS5A蛋白发生反应，具备良好的敏感性与特异性，同时也表明这些抗体能检测到CSFV的Em8、NS4A、N

7、S4B、NS5A亚细胞定位于PK—15细胞胞质中。关键词：猪瘟病毒Em8蛋白NS4A蛋白NS4B蛋白NS5A蛋白原核表达系统多克隆抗体PROKARYOTICEXPRESSION0FEm5、NS4A、NS4BANDNS5APROTEINSOFCSFVANDPREPARATIONOFTHEPOIⅣCLONALANTIBODIESABSTRACTClassica‘；winefever’widelyepidemic’theworldand。ourcountrClassicalSWlnetever1SwidelyeplOemlcintileworlOanOin