一种新型国产荧光显微系统及其在活细胞游离钙离子浓度检测中的应用

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1、_______________________________________________________________________________www.paper.edu.cn一种新型国产荧光显微系统及其在活细胞游离钙离子浓度检测中的应用11111兰李，瞿安连,周云燕，杨志勇，徐涛1湖北武汉华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与化学研究所（430074）lanli@hb165.com,alqu@mail.hust.edu.cn摘要：介绍一种新型国产荧光显微系统。在该系统中，氙灯发射的光线被椭球面镜聚焦后以衍射光栅分

2、光，而后通过光导和双路耦合镜传输单色光以激发细胞中的荧光探针发出荧光，最后用光电倍增管检测微弱荧光信号并进行计算机分析。本系统稳定、通用性强且易于保养，尤为重要的是在保持性能不降低的情况下成本远低于国外同类产品。实测光导端面输出光功率在波长为340nm下为28.0±4.5µw，380nm下为110.0±15.0µw，460nm～630nm＋下基本稳定在1.2-1.3mw。使用该系统，测定了高K去极化刺激下PC12细胞(大鼠嗜铬细2＋2＋胞瘤细胞)内[Ca]i变化的动态特性曲线。结果如下：静息状态下PC12细胞内[Ca]i为80.0

3、＋2＋±15.0nmol/l，高K去极化刺激可使PC12细胞内[Ca]i增加到1.9±0.2µmol/l，上升至2＋峰值时间约为20.1s。这证明了本系统可以满足检测活体细胞[Ca]i的需要。关键词：荧光显微系统、胞内游离钙离子浓度、椭球面镜、双路耦合聚光镜、PC12细胞。1．引言当代生命科学的发展，迫切需要超灵敏度的生命活动检测方法。荧光检测技术以其快速、无损和可对活体细胞观测的优势，已成为目前国际上主流的生物学及生理学研究手段。为满足我国生物学及生理学研究的需要，我们开发了国产的荧光显微系统并将其应用于生理学实验中。2．系统介

4、绍荧光显微系统可分为单色激发光源、荧光显微镜、荧光采集系统三个主要部分（如图1所示）。单色激发光源提供荧光的单色激发光，随后的光导与耦合镜将激发光引入荧光显微镜；荧光显微镜负责将激发光聚焦于样本平面，并将荧光信号成像于采集点；荧光采集系统（本系统采用光电倍增管，即PMT）采集并记录荧光信号。由于许多生理学实验（如荧光测钙）的过程中需要保证信号的采集与激发光波长的切换具有一定的同步性，因此需-1-_____________________________________________________________________

5、__________中国科技论文在线www.paper.edu.cn以计算机控制单色光的切换与信号的采集。图1荧光显微系统结构Fig.1Structureofthefluorescencemicroscope.本系统的创新之处体现在以下方面：2.1新颖的单色光源用于荧光显微系统的单色光源一般采用两种方式实现激发光的输出：滤光盘或光栅。由于滤光盘仅能输出几个波长的单色激发光，而光栅则可以实现在一定范围内波长内的连续调节，可适应多种不同的生理实验需要。故目前流行的荧光显微系统单色光源均采用光[1]栅分光的形式，其典型光路如图2所示(P

6、olychrome－Ⅱ，TILLPhotonicsGmbH)。与之对比，我们所研制的单色光源光路如图3所示。图2Polychrome-Ⅱ光路原理图（引自Yuste,F.Lanni,A.Konnerth,ImagingNeurons:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999,2.1-2.7）Fig.2SchematicdiagramoutliningtheopticalprincipleofthePolychrome-Ⅱ(citingfromR.Yuste,F.La

7、nni,A.Konnerth,ImagingNeurons:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999,2.1-2.7).-2-_______________________________________________________________________________中国科技论文在线www.paper.edu.cn图3单色光源光路原理图Fig.3Schematicdiagramoutliningtheopticalprincipleofmonoch

8、romator.与国外同类产品相比，本单色光源的最大特色在于我们使用了廉价的椭球面镜（ellipticalmirror）替代了造价昂贵且必须进口的环面镜（torodialmirror）。我们首先利用软件对两种反射镜的焦点能量进行模拟。使用同样亮度的