杜若抗旱性、耐荫性及其组织培养的研究

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ZhejiangA&FUniversityDissertationfortheDegreeofMaster生Studyonthedroughtresistance、shadetoleranceandtissuecultureofJapannesePolliaCandidate：ChuWeiyangAdviser：HeYunheprofessorSpecialty：OrnamentalPlantsandHorticultureDateofSubmission：April，2013ZhejiangA&FUniversityLin’an，zhejiangprovince，P．R．ChinaJune，2013重 独创性声明本人声明，所呈交的学位论文，在指导教师指导下，通过我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果，也不包含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的材料。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意。如被查有严重侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位论文作者亲笔签名：奎幽日期：垫丝．』：2论文使用授权的说明本人完全了解浙江农林大学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在——年后解密可适用本授权书。口不保密，本学位论文属于不保密。(／(请在方框内打“√”)学位论文作者亲笔签名：生叠幽日期：墅f；．!：7学位论文作者亲笔签名：叠叠豇墅堑日期：墅fj．!：7指导教师亲笔签名：—唾≥址日期：雀型三J幺莎 摘要杜若(PolliajaponicaThunb．)为鸭跖草科的草本植物，从古至今它都被人们作为一种药材来利用，但人们都忽略了它所具有的观赏价值。杜若是一种优良的观叶植物，到了夏天叶片鲜绿宽大，顶部开白花，园林方面开发利用的潜力很大。本文通过对杜若的抗旱性、耐荫性、组织培养及其园林应用研究，为今后杜若的引种栽培以及在园林中的应用提供理论依据。研究结果如下：(1)、抗旱性试验本实验在对杜若进行不同程度的干旱胁迫处理时，以杜若的形态、叶片保水力、土壤相对含水量、电导率、保护酶含量变化等一系列指标，对杜若抗旱性进行了初步分析。结果表明：经过20d的干旱胁迫处理和形态观测，半数以上的杜若植株死亡；在叶片保水力方面，干旱胁迫对杜若叶片保水力有较明显的影响；土壤相对含水量下降的速度在第5d后趋于平缓；电导率随着干旱胁迫天数的增加而逐渐上升；叶绿素含量的值呈先上升后下降的趋势；SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)活性变化以及可溶性蛋白含量的变化总体呈先上升后下降的趋势；MDA(丙二醛)含量变化比较复杂，呈先上升后下降再上升的趋势。(2)、耐荫性试验通过设置全光(CK)、50％、75％和90％遮荫4个梯度，研究遮荫对杜若生长特性、观赏特性、叶绿素含量变化、叶绿素荧光特性和光合日变化的影响。结果表明：随着遮荫梯度的加大，杜若的叶长和叶宽都比对照有所增加。实验处理90d后，杜若的叶绿素含量在75％遮荫梯度条件下最高；净光合速率日变化曲线呈双峰型曲线，遮荫梯度75％条件下杜若光合速率最大。在叶绿素荧光特性的测定中，和其它遮荫梯度相比，75％遮荫条件下杜若的Fm、Fv、Fv／Fo、Fv／Fm、qP的数值最大，Fo和NPQ数值最小；实验处理90d后，遮荫梯度75％条件下的MDA含量在所有遮荫处理中排名第三，MDA含量最大的是对照处理。POD和可溶性蛋白含量均为遮荫75％条件下的最高。综上所述，杜若适合在遮荫环境下生长，并且在遮荫75％条件下最适合生长，有比较强的耐荫性。(3)、组织培养试验采取幼嫩叶片或茎段带节的芽作为愈伤组织培养的外植体，接种后观察愈伤组织 摘要生成情况和褐化情况，记录愈伤组织生长状态等。结果表明：不同培养基类型对愈伤组织的发生率、愈伤组织类型的产生及褐化率有很大的影响。添加6-BA的培养基比不添加的诱导率高，6-BAlmg·Lq时，诱导率最高，为60．2％，明显高于6-BA含量为零时的39％。且随着6-BA的增加，诱导率会有所下降，但都会高于未添加时的诱导率，可证明6-BA可促进愈伤组织的诱导。水解酪蛋白的添加，相较于未添加时，愈伤组织的诱导率都有所提高。因此，杜若茎段带节的芽的愈伤组织诱导最适宜的培养基为：MS+2,4一D1mg。L‘1甘寸AA0．5mg·L。1+6-BAlmg·L。1+CH(水解酪蛋白)500mg‘L～。关键词：杜若，抗旱性，耐荫性，组织培养。II ABSTRACTABSTRACTJaparmesePolliaisherbagebelongtOCommelinaceae．Sinceancienttimesithasbeenusedasamedicinalmaterials，butpeoplehaveignoreditsornamentalvalue．JapannesePolliaisakindofexcellentornamentfoliageplants，thesummerleavesbrightgreengiant，topwhiteflowers，landscapedevelopmentandutilizationpotential．BasedontheJapannesePolliaifthedroughtresistance，shadetolerance，tissuecultureanditsapplicationinlandscaperesearch，astheintroductionandcultivationoffutureJapannesePolliaandtheapplicationingardensprovideagoodtheoreticalbasis．Theresultswereasfollows(1)、DroughtresistanceInthisexperiment，theJapannesePolliaweredifferentdegreesofdroughtstresstreatment，intheformofleafJapannesePollia，waterretention，thesoilrelativewatercontent，electricconductivity,thecontentchangesofprotectiveenzymeandaseriesofindexesofdroughtresistance，JapannesePolliawereanalyzed．Theresultsshowthat：after20daysdroughtstressandmorphologicalobservation，morethanhalfoftheJapannesePolliaplantdeath；inleafwaterconservation，出oughtstressonleafretentionofJaparmesePolliahadobviouseffectofhydraulic；relativesoilwatercontentdecreasedatarateoffifthdaftergently；conductivitywithincreasingdroughtstressdays．Graduallyincreased；chlorophyllcontentvaluewasfirstincreasedandthendecreased；SOD，PODactivityandsolubleproteincontentchangeingeneralwasftrstincreasedandthendecreased；thecontentofMDAchangewasmorecomplex，increasedfirstandthendecreasedandthenincreasedtrend．(2)、ShadetoleranceBysettingtheoptical(CK)，50％，75％and90％offourgradientshading，shadingongrowthcharacteristicsofJaparmesePollia，ornamentalcharacteristics，changesofchlorophyllcontent，chlorophyllfluorescencecharacteristicsanddiurnalphotosyntheticchanges．Theresultsshowedthat：withtheincreasingofshadinggradients，JaparmesePollialeaflenlg吐landleafwidewerebothhigherthancontr01．Resultsaftertreatmentfor90days，thecontentofchlorophyllJapannesePolliahighestat75％shadegradientconditions；netphotosyntheticratediurnalvariationcurveshoweddoubletshapecurve，shadinggradientof75％undertheconditionofmaximumJaparmesePolliarate．Inthedeterminationofchlorophyllfluorescencecharacteristics，comparedwithother75％gradientshading，shadingconditionsnumericalJapannesePolliaFm，Fv，Fv／Fo，Fv／Fm，qP，FoandNPQnumericalIII ABSTRACTminimum；experimentaltreatmentafter90days，thecontentofMDAshadinggradientof75％undertheconditionsoftherankedthirdinalltheshadingtreatment，thecontentofMDAmaximumthecontroltreatment．PODandsolubleproteincontentwerethehighestunder75％conditions．Insummary，ifJaparmesePolliasuitableforgrowingintheshade，andwasmostsuitableforgrowinginshade75％，arelativelystrongshadetolerance(3)、TissuecultureexperimentTheexplantstakentenderleavesorstemswithbudsascallusculture，callusformationwasobservedandthebrowningofcallusgrowthstateafterinoculation，recordsetc．．Theresultsshowthatthedifferentculturemediumoncallusoccurrenceandbrowningrate，rateofcallustypeshavegreatinfluence．Themediumadded6-BAratehighinductionratiodoesnotadd，6-BA1mg‘L"l,thehighestinductionrate，is60．2％，significantlyhi曲erthanthatof6-BAcontentiszero39％．Andwiththeincreaseof6-BA，theinductionratewilldecline，butwillbehigherthantheinductionratewasnotaddedwhen，+canprovethat6-BAcanpromotecallusinduction．Additionof．caseinhydrolysate，comparedtowithouttheinductionrateofcallus，theoverallincrease．ComprehensiveintermsofstemsegmentwithbudJapannesePollia，callusinductionofthemostsuitablemedium：MS+2，4-D1mg’L。1+NAA0．5mg’L。1+6-BA1mg‘L。1+CH(casein)500mg‘L‘1Keywords：JapannesePollia，droughtresistance，shadetolerance，tissueculture 目录曰习之摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IABSTRACT⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯II第一章前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．1杜若简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2植物抗旱性研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2．1干旱胁迫情况下植物的适应性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯11．2．2植物的．抗旱性指标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．3植物耐荫性研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯31．3．1植物的耐荫性机理⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．3．2植物耐荫性能力的排序⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．3．3植物耐荫性的评价指标⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．41．3．4从植物耐荫性探讨园林配置⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．3．5植物生理生化的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．3．6植物耐荫性指标的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．51．4植物组织培养研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．4．1单倍体育种⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．4．2胚胎培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．4．3原生质体培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．4．4其他方面⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．71．5研究目的、意义及内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯81．5．1研究目的、·意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯81．5．2研究内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8第二章抗旱性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯92．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．1．1试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．92．1．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102．2试验结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一132．2．1干旱胁迫对杜形态特征变化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2．2干旱胁迫对杜若叶片保水力的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯132．2．3干旱胁迫中土壤含水量的变化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯142．2．4干旱胁迫对杜若叶片相对电导率的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯152．2．5干旱胁迫对杜若叶绿素含量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．162．2．6干旱胁迫对杜若丙二醛(皿A)含量变化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．7干旱胁迫对杜若超氧化物歧化酶(SOD)活性变化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．8干旱胁迫对杜若过氧化物酶(POD)活性变化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯202．2．9干旱胁迫对杜若可溶性蛋白含量变化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．212．3小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．22第三章耐荫性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．233．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．1．1试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯233．1．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一233．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．23V 目录3．2．1遮荫对杜若叶片生长特性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．233．2．2遮荫对杜若观赏特性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．243．2．3遮荫对杜若叶绿素含量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．243．2．4遮荫对杜若叶绿素荧光特性的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．253．2．5遮荫对杜若净光合速率日变化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯303．2．6遮荫对杜若丙二醛(MDA)含量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯313．2．7遮荫对杜若过氧化物酶(POD)含量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯323．2．8遮荫对杜若可溶性蛋白含量的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯333．3小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯33第四章组织培养⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一354．1材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯354．1．1试验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．354．1．2试验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．354．2结果与分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯36第五章结论与讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～385．1结{念⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯385．2{寸论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯_⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯-．．40附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46个人简介⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．48致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．49 第一章前言第一章前言弟一旱月U苗1．1杜若简介杜若(PalliajaponicaThunb．)也称“地藕”、“竹叶莲”、“山竹壳菜”。多年生直立草本，高50．90cm，根茎细长，横走于地下。叶常聚于茎顶，长11．18cm，宽4．0．6．5cm，顶端渐尖，基部渐窄，暗灰绿色，表面粗糙，背面有毛；基部渐窄而形成带翅的叶短柄。圆锥花序顶生，由轮生的聚伞花序组成。有长总梗，梗有白细毛，花柄长2-4mm，有披针形苞片；花白色或蓝色。果圆球形，直径5．7mm，成熟时成深蓝色。花期6．7月，果期8．10月。杜若分布于长江流域，生于低海拔阔叶林下荫湿处，具有较强的耐荫性，喜湿润土壤。杜若植株高大，株丛茂密，绿叶浓荫，观赏价值极高，属于优良的林下地被植物，也可用于盆栽观赏【l捌，药用可疏风消肿、理气治痛。1．2植物抗旱性研究干旱、低温和盐碱是限制农作物产量的三大非生物因素，其中造成农作物损失最大的是干旱，其损失量远远大于其它因素造成损失的总和。干旱对植物的生长与繁殖、人类生活以及农业生产等方面有着极为重要的影响，其对世界农作物产量的影响，在众多自然灾害中占首要位置，其危害程度几乎等于其它自然灾害危害程度之和。所以，干旱是影响植物生长繁殖的首要逆境因素，研究植物的抗旱性对农业生产实践以及保护生态有着极为重要的作用。1．2．1干旱胁迫情况下植物的适应性干旱胁迫对植物的影响有很多方面，干旱会影响植物的光合作用、蒸腾作用等生理过程【3】，还会影响到植物的生长、发育、繁殖及植物的地理分布【4】。一些学者通过研究把植物能适应干旱的生理机制类型可分为3类：耐旱、御旱和避旱。并且还发现较高水位下植的物耐早生理机制不是逃避干旱而是组织脱水【5】。有学者把植物适应干旱的类型分为忍耐干旱、避免干旱与逃避干旱3种类型【6】。1．2．1．1干旱胁迫对植物生长的影响干旱对植物生长的影响有很多方面，影响的范围也很广。这类影响体现在植物生长发育的不同阶段，另外也影响着植物生理代谢的过程【，】。植物的生长发育受限是干旱胁迫对植物产生的最主要的机理反应【s】。至今，对干旱抑制植物生长发育的生理机制的定义为：干旱使植物细胞的生长受到抑制，因为植物细胞的生长最容易随着细胞内膨压的降低而被控制【9]o植物叶的生长发育在干旱环境下表现的最为明显[10，11】。在叶片水势为0．30"-'0．50MPa时，大多数植物的生理代谢效率就出现了降低趋势【12，”]。当植物长时间处于干 杜若抗旱性、耐荫性及其组织培养的研究旱环境，其叶片构造产生变化：叶片表皮的角质层加厚；表面积／体积比变小【14】。随胁迫程度的加强，植物节间变短。对根系生长的影响相对较小，结果根冠比提高【15，16】，降低了次生根的发生数量，但却增加了初生根上分枝根的形成[17，18】。1．2．1．2干旱胁迫与质膜透性和渗透调节干旱胁迫对植物的危害主要体现在细胞膜透性的上升[19】。研究人员发现，不同的苜蓿品种生长在干旱环境中，细胞膜透性都出现上升趋势【20】。植物的渗透调节这一概念由Hsiao最先提出【2l】。渗透调节是植物能否适应干旱胁迫环境的重要生理机制之一，植物自身进行代谢活动使细胞内溶质浓度增加，使渗透势降低，维持膨压，使体内与膨压相关的各种生理过程得到正常进行【22]。在干旱胁迫下，参与渗透调节的溶质主要是有机溶质(脯氨酸、可溶性糖等)和无机离子(CaR+、K+)等[23】，不同植物参与渗透调节的物质也是不同的[24】。在干旱环境下，脯氨酸是分布最广的渗透剂【25】，K+和可溶性糖是最主要的渗透调节物质【26】。目前对于旱胁迫的研究的主要调节物质是脯氨酸，在干旱胁迫后，脯氨酸可比原始含量增加到几十倍到几百倍【2，】。在对耐旱植物和喜荫植物的对比中，发现耐旱植物体内产生了更多含量的可溶性糖等糖类物质[2s】；植物体内糖类物质含量越高，越能在干旱环境下更好的生长发育【29】：刘崇怀指出在干旱胁迫下，‘葡萄的抗旱性与可溶性糖的积累没有相关的联系【30】。于同泉通过对板栗苗的研究，发现可溶性糖只有在干旱胁迫程度很高的情况下才有大量的积累【31]。大量植物在干旱环境下产生并储存了甜菜碱。有学者通过实验得出在植物体内产生并储存的甜菜碱可以减少干旱对植物产生的影响[32】。有人觉得用甜菜碱作为干旱胁迫的指标比脯氨酸更合适【33】。1．2．1．3干旱胁迫对植物光合作用的影响当植物处于干旱环境下，其光合速率会降低【34】。但随着干旱胁迫程度的增加，不同抗旱性的植物，光合速率下降的程度也各不相同，抗旱性弱的植物光合速率下降的幅度比抗性强的大【3s】。研究得出，在干旱胁迫下，植物的光合作用受到限制的原因是气孔与非气孔因素共同作用的结果[，s，3，】。在干旱胁迫下，叶绿素荧光参数也会发生相应的变化[3s】。植物处于干旱环境中，其气孔导度降低，导致蒸腾速率下降，使植物叶片的保水力增强，这是植物在缺水的情况下做出的有效反应【，9】。一些学者研究发现，叶片气孔导度与植物的蒸腾作用呈现出正比的关系，蒸腾作用在细胞内水分中具有至关重要的地位，它体现了植物细胞内水分的利用以及运输情况，并且也决定着植物光合作用的发生[40】。1．2．1．4干旱胁迫与干旱诱导蛋白当植物处于干旱环境中，体内会合成一种新的蛋白，研究人员将这种蛋白称为干旱诱导蛋白[41】。植物体内的干旱诱导蛋白系统对干旱胁迫而做出的反应可总结为以下几种不同的变化：在正常和非正常情况下，合成的蛋白质会分别出现减少和增加的趋势【。2]。干旱诱导蛋白能够防止植物细胞受到损伤，它是植物在于旱胁迫下对其进行保 第一章前言护的主要因素【43】。Lea蛋白为干旱诱导的一类亲水蛋白，广泛存在于高等植物中，特别在胚胎发生后期的种子中大量积累【删。除Lea蛋白外，液泡膜上的水孔蛋白(AQPs)也是研究较多的一种干旱蛋白，它是一类具有选择性的高效转运水分子功能的膜通道蛋白【45】。植物体通过调节水孔蛋白等膜蛋白的含量，从而改变细胞对环境的适应，增强细胞膜的通透性，使得植物的抗旱能力得到提高【46】。1．2．1．5干旱胁迫与活性氧积累一般来说，植物体细胞内积累的活性氧和其清除系统保持着平衡的关系【。7】。但当植物处于干旱环境中，其产生的活性氧使植物细胞受到伤害[48】。植物干旱环境中，虽然叶片固定二氧化碳的速率降低，但光合电子却进行着高速传递，使得氧气更容易接收到光合电子，以至于氧气含量大大降低。植物体内产生过多的氢氧离子和阳离子等活性氧自由基，导致细胞膜大量氧化，致使多数膜系统收到伤害，细胞功能失活乃至死亡【49】。其中PSI和PSII受到的损伤与活性氧的积累也有直接的关系【50]。植物体内自身生成了防御系统以致于减少活性氧对植物造成的损伤。在干旱胁迫初期POD与SOD都呈现出增长的趋势。可是由于干旱胁迫日期的延长，POD与SOD的活性逐渐下降Isl]，MDA则缓慢上升【52】。张立军研究玉米在干旱胁迫下时，得出在干旱胁迫初期GSH含量立刻上升，但干旱胁迫时间的推移，植物体内GSH含量显著减少【53】。1．2．2植物的抗旱性指标不少研究人员对植物抗旱性能力的判定进行了大量实验，提供了很多关于植物抗旱性的指标，例如植物的形态、生长以及生理生化指标等。宋莉萍总结出植物抗旱性指标有以下方面：首先是生理指标，例如叶绿素含量、叶片膨压、光合速率、蒸腾速率、质膜透性、叶片保水力等。其次是生化指标，例如脯氨酸含量、保护酶系统、丙二醛含量和可溶性糖含量等。最后是形态特征，例如植物的叶长叶宽、叶片解剖结构、根冠比等【54】。表示植物抗旱性指标有很多，不能单方面的从少数的指标来判定植物的抗旱性能力。应该从植物形态特征、生理特征、叶片构造、生长情况等方面进行全面鉴定。1．3植物耐荫性研究由于植物耐荫性和植物光合作用是紧密相关的，所以众多学者在光对叶片结构、植物的生长状况、叶绿体含量和形态、叶绿素的影响以及光学性质对植物内部器官的影响、植物二氧化碳气体交换等因素做出了详细地探讨。植物耐荫性是指植物在遮光环境下的生存特性，植物为能够在光线较弱的环境中生存而进行各种有助于其生理特性的变化，以致维持本身生理代谢的平衡，且能进行 杜若抗旱性、耐荫性及其组织培养的研究正常的生命活动【55】。决定植物的耐荫性能力主要有两种因素：一是植物自身的生理特性，二是植物对光照强度变化的适应能力。植物对弱光照的反应，主要为两种类型：忍耐遮荫和避免遮荫【56】。1．3．1植物的耐荫性机理遮荫性强的植物，都有下面几个的特征：一是要具有吸收光能极强的光量子：(1)形态方面做出改变：植株体型长与细，分枝少【5，】；小枝与叶片向增加与光量子的有效接触点方向分布，耐荫性强的植物叶片表面光滑，叶片面积增加、比重低【58】；(2)叶绿素含量的改变：叶绿素含量随着光量子密度的减少而上升，但叶绿素a／b的值却随着光量子密度的减少而降l'L乇tm；(3)叶片结构中：海绵组织丰富，细胞层数减少，但在植物体内几乎没有栅栏组织细胞【60]，细胞内气孔数量与叶绿体数目都趋向于下降【6l】，叶绿体形状为长串状[62】。二是要加大光能利用率：(1)耐荫性弱的植物要在有弱光环境下用尽可能大的吸收力进行最大力度的光合作用；(2)利用细胞中各种组织的叶绿体光合作用特征的差异，以致与不同的光照环境相互协调。最后是要使植物自身内部耗能得以降低：即叶片及根的呼吸强度低，叶片的暗呼吸较弱【63】。1．3．2植物耐荫能力的排序白伟岚等对50多种园林植物的耐荫性进行比较，将园林植物区分为强耐荫、较耐荫、中性和不耐荫4类【64】。伍世平以叶绿素砒的值为2．3作为耐荫性的标准值，将11种地被植物分为耐荫性强、耐荫性较强、耐荫性较弱、近阳性植物4类【65】。张德顺等测定了24个园林植物的几个指标，将它们划分为耐荫性较强、耐荫性中和耐荫性较弱3类。孙谷畴等将焕镛木划分为阳性植物，观光木划分为阴性植物【66】。敖慧修对室内植物在不同光照条件下的生长量，单位叶面积质量，叶面积和叶的结构，光合能力等做了进一步的研究，并划分了植物耐荫性强度的等级【67]。岳桦等对龙骨、量天尺、石莲的光补偿点、光饱和点、气孔密度、叶绿素含量及比值进行了研究，得出它们的耐荫行能力排序是龙骨>量天尺>石莲【68】。1．3．3植物耐荫性的评价指标中科院华南植物研究所和广州市园林科研所共同研究表明植物生长量、叶面积、单位叶面积、叶片结构、干鲜重及光合特性与耐荫性能力有着密切的关系。陈绍云等经过研究得出叶绿素总量及a／b值与植物耐荫性有一定的相关性f69】。罗宁通过对8种室内观叶植物的内部构造进行观察，得出了植物内部结构与耐荫性的关系【，o】。白伟岚等认为光补偿点以及光饱和点可以准确地判断植物耐荫性能力的大小，而叶绿素含量及叶绿素的a／b值的高低与耐荫能力是否有关联还需要更深的研究【71]。张庆费建立了表皮厚度、细胞组织、光补偿点和叶绿素b等指标组成的园林植物耐荫性判断指标的体系【72】。荧光参数中的Fv／Fm值也可作为判断植物耐荫性的指标【，s】。植物在遮荫环 第一章前言境下的生长状况也可以作为判断植物耐荫性的一个重要指树，t】。一些学者还将叶绿素a与b的含量、a／b值和光合作用的光饱和点、光补偿点以及量子效率作为判断耐荫性能力的重要指标，将在弱光环境下表现出低的a／b值、光饱和点、光补偿点和较高量子效率划为耐荫性强的植物类夏JlJ[75]。1．3．4从植物耐荫性探讨园林配置成功的园林植物配置主要是由植物的耐荫性来作为标准，这与植物正常的生理活动，生态结构的稳定以及植物最佳景观效果的问题息息相关。周道瑛对北京人工栽培植物进行了相关调查，从众多耐荫植物种挑选出了几种耐荫性强的植物，并结合不同植物的耐荫性能力设计了新疆杨、白皮松一多花枸子一野生草群落；金银木、菱叶绣线菊一红花刺槐一野生草群落；槐树、桧柏、欧洲琼花一野生草群落等几个群落模式【76】。许实在对长春藤等10种植物耐荫性研究的基础上，列出4种室内小花园群落配置模式，分别为观花、观叶、同类植物以及观叶观花混合栽培的群落模式【77]。1．3．5植物生理生化的研究对叶绿体含量及其形态大小的研究得出：随着光照强度的降低，叶绿体体积将增大、数目会增加、叶绿体呈连续状或狭长串状排列。通过叶绿体内部结构的研究表明：海绵组织内的叶绿体比栅栏组织的具有更多的堆叠的基粒层、更高的堆叠类囊体及类囊体与间质的容积比【78】。耐荫植物叶绿素含量的变化趋势与光量子密度的变化呈反比，但叶绿素a／b值的变化却与光量子密度的变化呈正比1791。研究表明：阳生植物与阴生植物的量子效率是大同小异的【80】，阴生植物在光照强度较高的情况下量子产数会下降【81】。植物PSU与植物的耐荫性存在着紧密的联系，Malkin和Fork对8种阳性植物和6种阴性植物进行研究并得出结果，阳性植物PSU的大小变化范围为220．540(叶绿素／作用中心)，而阴性植物PSU的大小范围为630．940(叶绿素／作用中心)[82]。1．3．6植物耐荫性指标的研究1．3．6．1遮荫对叶绿素总含量的影响当植物进行光合作用活动时，植物体内生成的色素就是叶绿素。叶绿素的主要功能是吸收并传递光电子。一些研究表明，叶绿素的总含量(叶绿素a+b)随着光强的减弱而增大，但叶绿素a／b的值却随着光强的降低而减小，这样就能够增加植物对远红光和绿光吸收的效率。当植物在弱光照环境下，叶绿素a／b的值越低或者叶绿素总含量越高，植物所进行的光合作用的能力也就越大，植物体内的色素除了叶绿素a和叶绿素b这两种主要的色素以外，还存在着一些对光合作用起辅助性作用的色素。虽然只是辅助性色素，但这些辅助性色素在植物进行光合作用的活动中还是能起到不可忽视的作用，例如胡萝卜素，其含量的增长可以减少紫外线辐射造成的损伤以及叶绿素光氧化等。遮荫处理可以很大地提高了叶片中叶绿素总含量。任婷等通过对5种暖 杜若抗旱性、耐荫性及其组织培养的研究地型草坪草的进行遮荫试验后，发现随着遮荫梯度的增加，叶绿素总含量均大于未做遮荫处理的，呈现出增长趋势【83】。通过观察各种草坪草的形态变化，发现随着光强的减弱，叶色越来越深【84]。这类变化趋势在其它实验中也得到了相应地证实，报道也比较多【85．87】。相反，一些学者通过研究则认为遮荫会导致叶绿素总含量降低。有些研究人员发现匍匐剪股颖长期处于遮荫环境下，叶绿素含量的降低而引起其叶色变浅；遮荫处理也显著减少了高羊茅体内的叶绿素含量，这类报道在其它的一些遮荫实验中也出现过【88，89】。在对一些彩叶植物的研究中得出较弱的光照强度可以导致叶绿素含量减少的结论，其原因也许是由于较低的光照强度对叶绿素的组成产生了负面影响【90]。上述两种试验结果恰恰相反的原因目前还没有一个明确的答案。此外还有另外的研究得出了与上述两种不同的结果，例如有学者发现两种野生假俭草，其在经过短期的遮荫处理后植物体内叶绿素含量会增加，但是长期的遮荫处理后植物体内叶绿素含量反而会减少，也许是植物对环境的改变而出现的紧急反应与植物在各种生长阶段对遮荫的适应度有一定的关系。正常情况下，在遮荫条件下蓝紫光是太阳光中主要的可见光，而植物体内的叶绿素b有着很强的吸收蓝紫光的能力，当植物处于遮荫环境下，’植物体内的叶绿素b含量的会出现明显的增加，这样可以使植物对蓝紫光的吸收利用率大大提高，以便适应光线弱的逆境【9t】。通过研究野生假俭草得出，在遮荫处理下假俭草的叶绿素a／b值的变化与叶绿素含量的变化成反比，但与遮荫时间的多少有关系：叶绿素a／b的比值与遮荫时间的长短成正比关系。在其它的研究中也得到了遮荫使叶绿素a／b的比值下降的结论。另外一些研究人员发现，遮荫可以导致乌拉苔草叶绿素b的含量随季节的转变而减少【92】。1．3．6．2遮荫对植物叶绿素荧光的影响叶绿素荧光动力学在测定光合作用功能的方面起到决定性的作用【9s】。叶绿素荧光在光合作用不同的阶段中都有一定的关联，叶绿素荧光动力学能反映任何逆境对光合作用的影响。在叶绿素荧光特性的各项指标中，初始荧光fFo)是主要是判断PSII反应中心运转的情况，Fo值增加则表示PSII反应中心运转出现破坏的情况。Fv／Fo主要是鉴定PSII的潜在活性。蔡永萍等经过研究得出光照强度的增加会使得石斛PSII活性降低，光照强度为800um01．m-2．s。时，叶绿素荧光参数的值骤降【94】。Fv／Fm值也是主要的叶绿素荧光参数之一，它主要是用来判定开放的PSII反应中心对激发态电子的捕获率，Fv／Fm值越低说明光合作用受到了更严重的光抑制【95】。研究人员发现在遮荫处理下，加拿大一枝黄花的Fv／Fm值与未遮荫处理的相比，数值偏高，这个研究结果表明了遮荫处理对PSII反应中心开放比例的提高起到关键作用【96】。1．3．6．3耐荫植物光合作用曲线研究耐荫植物和喜光植物的光合作用曲线存在区别，耐荫植物的光补偿点会转移到相 第一章前言对较低的光强区域，大多数植物利用叶片的正面来吸收光量子，使植物细胞各组织内的叶绿素光合特性不同；这些光量子到达海绵组织的光照强度减弱，且红光与绿光占据相对较大的比例，使得海绵组织吸收利用光量子的效率大大提高；相反，尽管栅栏组织吸收光量子的效率相对较低，但叶绿体可以弥补栅栏组织吸收光量子低效率的不足：不一样的植物有着不一样的特性，使得它们的光合曲线的变化也存在着差异。研究表明，耐荫植物与喜光植物相比，有着更低的光饱和点、光补偿点以及净光合速率，通过分析不同种类的植物对光能、二氧化碳的吸收及利用率的差异，以致判定这种植物的耐荫程度。1．4植物组织培养研究1．4．1单倍体育种单倍体育种在培养的过程中用秋水仙素进行处理，可使染色体加倍得出纯合二倍体植株，这种培养技术应用在育种上被称为“单倍体育种”。单倍体育种具有高效率、高速、基因型一次纯合等多数优点。因此，通过花药、花粉培养的单倍体育种技术已经作为一种全新的育种手段，开始作用于大面积种植的作物新品种。我国从上世纪七十年代开始至今，已经利用花粉、花药培育出了40多种植物单倍体植株，其中甜菜、油菜、白菜、大豆和甘蔗等单倍体植株成为我国首,包lJ[97,99]。目前，花药、花粉培养作为一种全新的育种方式在植物育种研究工作中发挥不可动摇的作用。1．4．2胚胎培养在植物远缘杂交中，杂交不育是远缘杂交中最大的障碍，而采取胚胎的离体培养可使胚胎正常发育，并且可以成功地培养出后代。胚培养已经在50多个科、属中获得了成功。中国科学院植物研究所与北京市农林科学院合作，通过胚胎培养培育成的早熟桃新品种“京早3号”，成熟期比一般的桃提前15．20d早熟。此外，荔枝、龙眼的焦核胚胎培养研究，为果树培育出优良的焦核品种开创了新道路【99】。1．4．3原生质体培养到上世纪90年代初期，我国已获得30多个品种的原生质体再生植株，包括难度比较大的小麦、水稻、高梁、玉米、棉花、谷子等。原生质体培养的成功，使体细胞融合技术得到了快速发展【100】。1．4．4其他方面组织培养技术在突变体育种、药用植物培养以及种质资源保存等方面也有了较新的进展。例如，突变体育种方面已经选育出了抗花叶病毒的甘蔗无性系。抗1％一2％NaCl的野生烟草细胞株等。利用植物组织培养技术低温保存种质，可以节约人力、 杜若抗旱性、耐荫性及其组织培养的研究物力和土地，还可以拯救濒危物种【101】。同时，离体保存的材料不受病虫害侵染、不受季节的限制，利于种质资源的地区间以及国际间的转移和交换，给保存与抢救的有用基因带来了新希望。1．5研究目的、意义及内容1．5．1研究目的、意义杜若叶片鲜绿宽大，花白果蓝，遮荫效果好，易繁殖栽培，可观叶赏花，园林开发利用潜力大。杜若的种质资源情况、药用价值已有些许报道和研究，但其抗旱性、耐荫性及园林应用还没有深入的研究，杜若的园林观赏价值还没有得到人们的重视，仍然是藏在深山人未识，没有在园林绿化中发挥应有的作用。因此，本论文在查阅相关文献和做调查的基础之上，在浙江省泰顺县乌岩岭采集杜若植株，并调查其生长环境，然后在浙江农林大学校园内进行抗旱性、耐荫性及组织培养试验，为杜若园林绿化应用等提供相关依据。1．5．2研究内容本文的研究内容主要包括以下几个部分：(1)、抗旱性试验：采取盆栽自然干旱法，以控制其水分对杜若进行干旱胁迫，以开始胁迫的第二天作为对照处理，5d作为一个处理周期，共进行4个处理周期，共处理20d。研究不同干旱胁迫程度对杜若的各项生理指标变化的影响。(2)、耐荫性试验：用遮阳网设置4个遮荫梯度：分别是全光(CK)、50％、75％、90％遮荫。研究不同遮荫梯度对杜若的生长状况、叶绿素含量变化、叶绿素荧光特性以及光合日变化的影响。(3)、组织培养试验：采取幼嫩叶片或茎段带节的芽作为愈伤组织培养的外植体，接种后观察愈伤组织生成情况和褐化情况，记录愈伤组织生长状态等。 第二章抗旱性2．1材料与方法2．1．1试验材料2．1．1．1杜若野外生境根据相关文献资料，在浙江省泰顺县乌岩岭对杜若的生境进行野外调查。主要内容有：气温、湿度、生长环境、野外生理情况和伴生植物等，调查地点为浙江省泰顺县乌岩岭，海拔500．800m，生境为路边溪旁，土壤为山地黄壤，土层较深厚。伴生植物主要有：(1)、乔木层：青冈栎(Cyclobalanopsisglauca)、青榨槭(Acerdavidi0、盐肤木(Rhuschinensis)、杉木(Cunninghamialanceolata)、木荷(Schimasuperba)、毛竹(Phylloctachyspubescens)等。(2)、灌木层：满山红(Rhododendronmatqesii)、小果蔷薇(Rosacymosa)、算盘子(Glochidionpuberum)、槛木(Zoropetalumchinense)、毛花连蕊茶(Camelliaj务aterna)、野鸦椿(Euscaphisjaponica)、马醉木(Pierisjaponica)、马银花(Rhododendronovatum)、紫珠(Callicarpabodinieri)、老鼠矢(Syn@locosstellaris)、雀梅藤(gageretiarhea)等。(3)、草本层：蛇莓(Duehesneaindica)、过路黄(Lysimachiachristinae)、芒萁(Dicranopterisdichotoma)、紫萁(Osmundajaponica)、田麻(Corchoropsistomentosa)、冷水花(Pileanotata)、兔儿伞(syneilesisaconitfolia)、博落翅(Macleayacordata)、地锦(Euphorbiahumifusae)、三脉紫苑(Asterageratoides)等。(4)、层间植物：海金沙(Lygo功'umjaponicum)、扶芳藤(Euonymusfartune8、清风藤(Xabiajaponica)、中华猕猴桃(Actinidiachinensis)、络石(乃'achelospermum／asminoides)、三叶木通(AkebiatHfoliata)、刺葡萄fHtisdcwidi8、珍珠莲(Picussarmentosavar．hemyi)等。2．1。1。2材料采集与保存材料采自浙江省泰顺县乌岩岭的杜若野生苗。通过直接挖掘植株的方法，在2012年4月10日将植株带土移植后，放入编织袋中，第二天种植于浙江农林大学东湖校区园林学院温室大棚的苗圃地上。植株移植到实验地后，首先对根部进行修剪，剪去有损伤的根系，然后剪去病虫害叶片，最后将修剪好的植株埋于土内，栽后立即浇透水。并在每天下午4点左右适量喷水，以利于植株移栽成活。在日常的管理中，主要采取浇水、施肥、修剪、防治病虫害等措施。 杜若抗旱性、耐荫性及其组织培养的研究2．1．2试验方法在2012年7月初从盆栽苗中筛选出形态相同、长势整齐的盆栽苗进行抗旱性实验，以控制其含水量为方法进行抗旱性试验。具体内容为从7月15日起对所筛选出来的所有杜若盆栽苗停止浇水，实验过程中每5d测定其形态指标等变化，包括形态变化、叶片保水力、土壤含水量、叶绿素含量、叶片相对电导率和酶活性等指标，每个处理5盆，并重复3次，每次取形态较大、叶色较绿、无病虫害的叶片为试验材料进行混合取样。2．1．2．1形态观察在试验进行的过程中，每5d观察一次杜若叶片的形态、叶色、有无病虫害等情况。2．1．2．2土壤含水量的测定每次取花盆内的土壤5g，放进铝盒。在烘干前记录土壤重量Wl，然后放入烘烤箱直至将土壤中的水分完全烘干，记录土壤重量W2。用公式：W2／Wl*100％得出土壤含量量的百分比。每盆重复3次，每5d测定一次。2．1．2．3叶绿素含量的测定叶绿素含量测定的方法为：将杜若叶片采集至实验室后快速洗净后并擦干，然后将叶片的中脉剪去，再将叶片剪成长和宽为3．4ITIIYI左右的碎片，并装入密封袋中，共做3次重复，称0．2g碎叶片，加进试管内，然后加入浓度为95％的乙醇溶液10mL．在每个试管上进行标记，把标记的试管放进黑色塑料袋，并置于黑暗环境中静置至少24h，等到叶片颜色完全发白时，再将试管取出。把杜若的叶绿素提取液摇匀后倒入比色皿中，用乙醇作为对照，用岛津UV-2450分光光度计在波长D645nm、D663nm下分别测出相应的光密度(OD)值，再按照公式计算出叶绿素a，叶绿素b，叶绿素总量的值。叶绿素a=(12．7D663．2．7D645)*IV／(1000木W)](2．1)叶绿素b_-(23．1D645．4．65D663)*[V／(1000*W)1(2．2)叶绿素总量=叶绿素a+叶绿素b(2．3)上述公式中：D“5、D663为叶绿素提取溶液在波长645nm、663nl／l下的吸光度值，V为叶绿素提取液总体积(10mL)，W为进行试验的杜若叶片的鲜重(g)。2．1．2．4叶片相对电导率测定测定方法为：先用自来水大力冲洗叶片表面，再用蒸馏水精洗3遍。洗完后用滤纸将残留在叶片表面的水滴擦干，并将叶片主脉剪去，将叶片剪成长和宽为3．4mm左右的碎片，装入密封袋中，并在冰浴中保存。取碎叶片0．2g，共做3个重复处理，将碎叶片放进有盖的试管内，加入20mL蒸馏水，在常温状态下静置20min，20min后开始用电导仪测出数值。在常温下用电导仪测出电导率S，，然后将试管放进100℃ 第二章抗旱性的沸水中加热10rain，10min后将试管取出，直至完全冷却后测出电导率S2，用公式计算出相对电导率，So为蒸馏水的电导率。相对电导率(％)=($I-So)·($2-So)。1(2．4)2．1．2．5酶液的提取先将采集的用作于试验材料的叶片洗净后并擦干表面的水分，然后将中脉剪去，再将叶片剪成长和宽为3-4mm左右的碎片，装入密封袋中，并在冰浴中保存。称取上述碎叶片O．5g，放入洗净并晾干的研钵中，并加入pH=7．8的磷酸缓冲液5mL，在冰浴环境下进行研磨，直至将碎叶片磨成浆状，加进离一th,管内，再加入提取介质并用提取介质冲洗研钵，将提取介质与残留的磨浆一起倒入离心管内，使离心管内的溶液体积最终定格为10mL，在5℃下6000rpm的离心机上离心20min左右，离心后得到的上清液即酶提取液，将酶提取液加入离心管，放入5℃冰箱保存，用来进行SOD、MDA、POD、可溶性蛋白含量等指标的测定。2．1．2．6SOD活性测定先将采集的用作于试验材料的叶片洗净后并擦干表面的水分，然后将中脉剪去．再将叶片剪碎，装入密封袋中，在冰浴条件下保存。取0．5g碎叶片放入干净的研钵中，加入2mL的提取介质，在冰浴下充分研磨直至成浆，再加入提取介质冲洗研钵表面残留的浆，一并倒入试管中，并使试管中溶液体积最终定格为10mL，然后在5℃下15000r／min的离心机上离心20min，离-th,完成后，得到的上清液就是SOD酶液。取透明度相同的、良好的试管，在弱光照的环境下依次加入1．5mLO．05mol·L‘1pH=7．8的磷酸缓冲液、O．3mL75umol-L‘1的NBT溶液、0．3mL13mmol·L。1的甲硫氨酸溶液、O．3mL10umol-L-1的EDTA-Na2溶液、0．3mL2umol·L-1的核黄素溶液，加入0．5mL的蒸馏水，最后加0．1mL酶液。取2支加入相同溶液的试管，不加酶液，一支用深色布遮光用于暗对照，另一支不做任何遮光处理用于光对照，把所有试管全部放入光照培养箱里，在温度为20℃的环境下，处理20min后取出试管，并测出光密度值。SOD活性=【(Ao．As)·VT】／(0．5·WF·V1)(2．5)式中：SOD活性为1个酶活单位每克(u·g。1)，Ao为照光对照管的光吸收值，As为样品管的光吸收值，VT为样品溶液总体积(mL)，V1为测定时样品体积(mL)，WF为试验材料的鲜重(g)。2．1．2．7IdDA含量测定取1mL酶提取液并加入试管内，然后加入1mL浓度为0．6％的硫代巴比妥酸和3mL浓度为10％的三氯乙酸，将试管内的反应液放入90℃的沸水中进行保温，20min后取出试管，并快速放入冰浴中进行冷却，冷却后在4000r／min的离心机上离心10min，得到的上清液用浓度为0．6％的硫代巴比妥酸溶液进行对照，分布测出在波长为450nm，532nrfl和600nm下的吸光度(OD)值。 杜若抗旱性、耐荫性及其组织培养的研究MDA含量(umol／g)=『6．452*(ODs32．OD600)-0．559车OD450]木V1木(v2术W)。1(2。6)式中：Vl为提取液体积(mL)，V2测定时所用的提取液的体积(mL)。2．1．2．8POO活性测定取浓度为50mmol／LpH=6．0磷酸缓冲液100mL放入烧杯中，然后加入愈创木酚30uL，在搅拌器上进行震动搅拌，使得愈创木酚充分溶解于磷酸缓冲液中。待溶液完全冷却后，加入20uL浓度为30％的双氧水，将烧杯里的混合液充分搅拌，所得的混合液就是POD反应液。取3．9mLPOD反应液，加入0．1mL酶液，在波长470ni／]下进行比色，每15S记录一次，共记录8次，记录所有的光密度值。POD活性=(△A470*VT)／(o．01木WF牛Vs木t)(2．7)式中：△A4，o为反应时间内吸光值的变化，VT为提取液的总体积(mL)，WF为样品鲜重(g)，Vs为测定时样品体积(mL)，t为反应时间(min)。2．1．2．9可溶性蛋白含量的测定用考马斯亮蓝G．250染色法进行测定，在1h内测完。分为以下几个步骤。蛋白质标准液的制取：取0．1g牛血清蛋白，放入装满100mL蒸馏水的烧杯中，使得牛血清蛋白完全溶解，配成1000ug／mL的蛋白质标准液。考马斯亮蓝G．250试剂的制取：‘取0．1g考马斯亮蓝G-250，加入至50mL浓度为95％的乙醇溶液中，待完全溶解后，再加入100mL浓度为80％的磷酸，最后用蒸馏水定容至1000mL。取6支试管，按表3．1配置0．1000ug／mL牛血清蛋白溶液各1mL。用移液枪吸取所配溶液0．1mL，分别加入到10mL的具塞试管内，加入5mL考马斯亮蓝G．250试剂，盖上塞子，并充分摇匀试管中的溶液，静置2min后，在595am下比色。将蛋白质浓度用作为横坐标，吸光度值用作为纵坐标，制出蛋白质含量的标准曲线。样品提取液内可溶性蛋白含量测定：用移液枪吸出样品提取液0．1mL，加入到具有瓶塞的试管中，加入5mL考马斯亮蓝G．250试剂，混合静置2min后，在波长595nm下比色，记录下吸光度值，并查询标准曲线中的蛋白质浓度(ug／mL)，以蒸馏水作为空白对照。表2．1牛血清蛋白配制表Table2．1ThepreparationtableofBovineserllmalbumin样品蛋白质含量(mg／g鲜重)=C木V／(W木1000)12(2．8) 第二章抗旱性式中：C标准曲线所得试管蛋白质浓度ug／mL，V提取液体积mL，W样品质量2．2结果与分析2．2．1干旱胁迫对杜若形态特征变化的影响干旱胁迫对植物的影响，主要体现在其外观形态的改变方面。当植物长时间受到干旱时，植物的形态方面就会产生不正常的变化，当干旱胁迫时间进一步延长，干旱胁迫程度继续加大，植株形态就会趋向枯萎，叶片表面出现斑点，叶色变黄，直至死亡。表2．2干旱胁迫下不同时间内杜若叶片颜色和形态的变化Table2．2ChangesofJapannesePollialeafcolorandshapeindifferenttimeunderdroughtstress由表2．2可知，杜若在抗旱试验初期可以进行正常的生理活动，形态方面没有变化。但随着干旱胁迫时间的不断增加，杜若植株体内所保持的水分就越来越少，杜若植株的形态特征出现明显的变化。具体表现为：在干旱胁迫5d时，杜若叶片出现部分萎蔫现象，但叶色还算正常；在干旱胁迫10d时，杜若植株由于体内缺水越来越严重，叶片开始明显出现萎蔫现象，并且叶片颜色变浅；在干旱胁迫的15d时，杜若植株体内进一步缺水，植株形态的表现进一步恶化，叶片颜色明显变浅；在干旱胁迫的20d时，杜若植株体内完全脱水，叶片表现为边缘浅黄，卷曲，萎蔫，大量植株死亡。综上所述，杜若不能在长期干旱的环境下进行正常的生长。2．2．2干旱胁追对杜若叶片保水力的影响大量试验研究表明，叶片保水力的大小作为判断植物在干旱胁迫下的抗旱性程度的一个指标，单位时间内失水量越少的植物，其叶片保水力越强。 杜若抗旱性、耐荫性及其组织培养的研究2h4h6h8h1Oh12h14h时间图2．1干旱胁迫下杜若叶片保水力在14h内的变化Figure3．．Changesofwaterwithinthe14hoursJapannesePollialeavesunderdroughtstress杜若在干旱胁迫的前段时间叶片具有很高的失水率，但随着时间的延长，失水率逐渐变缓。在6h内叶片水分散失己接近60％，14h后叶片水分己散失80％，但在6h至14h之间失水率只增长了20％。试验结果表明，干旱胁迫对杜若叶片保水力有较明显的影响(图2．1)。2．2．3干旱胁迫中土壤含水量的变化植物生长所需的大量水分绝大多数来源于土壤中的水分，并由植物根系从土壤吸收，以使植物进行正常的新陈代谢活动。所以植物的生长状况主要由土壤中含水量的情况来决定。本试验探讨了干旱胁迫与土壤含水量的关系。5d10d15d20d干旱胁迫天数图2．2干旱胁迫下土壤相对含水量的变化Figure2．2Effectofsoildroughtstressontherelativewatercontentofsoil0O0O86421—96一丑惫陋岛删*却啦蛆哪*水∞加0一’6一删繁邻靛巽j耋{f刊 第二章抗旱性在整个试验中土壤相对含水量从最初的78．8％降至12．3％。其中表现为干旱胁迫初期(0．10d)土壤含水量下降速度较快，含水量下降速度平均每天5．76％。第5d以后含水量下降速度较为平缓，下降速度为平均每天0．89％。原因是干旱胁迫初期．土壤含水量较高，但失水速度快，这时的土壤通过渗漏和地表蒸发，还有杜若本身的蒸腾作用等导致水分大量散失。到第5d后，水分的散失主要由杜若的蒸腾和水分蒸发为主，使得土壤水分下降速率平缓。这些数据表明杜若在试验过程中受到的干旱胁迫，具有一定规律性(表2．3)。表2．3干旱胁迫下土壤相对含水量的变化Table2．3Effectofsoildroughtstressontherelativewatercomemofsoil注-：处理间标有不同小写字母为p遮荫90％>遮荫50％>CK。表3．1遮荫90d后杜若叶绿素含量的变化Table3．1ChlorophyllcontentchangesofJapannesePolliaafter90daysshading注·：处理间标有不同小写字母为p<0．05水平差异显著，标有不同大写字母为p2>3>4。另又比较了水解酪蛋白的添加对愈伤组织诱导的影响。从表4．1和表4．2中可看出，水解酪蛋白的添加，相较于未添加时，愈伤组织的诱导率整体都有所提高：最高的是在6-BA为1mg．L。1时，诱导率由原来的60．2％提高到了现在的63．3％。但诱导率仍和添加6-BA的效果一致，为培养基5>6>7>8。综合以上分析，诱导率方36 第四章组织培养面，最适合的培养基为6-BAlmg·LJ且添加了水解酪蛋白500mg·L一的培养基，即5号培养基：MS+2,4．Dlmg·L．1+NAAO．5mg·L’1+6-BAlmg·L。1+CH(水解酪蛋白)500mg。L一。良好的愈伤组织诱导率方面，利用Duncan多重比较发现，不同培养基下诱导率差异达到了显著水平。且最高的为5号培养基，63％的为黄白色或浅黄色，多数结构致密，颗粒状，胚型的愈伤组织，不易褐化，利于保存与增值分化，之后为60．2％的1号培养基，这与上面的结果一致。5号培养基为最佳。激素的添加使得愈伤的褐化率也相应的增加。综合起来看，最低的为未添加6-BA的培养基，为23。1％(附图1)，褐化率最高的是6-BA浓度为3mg·L．1时，达到了28．3％(附图2)。从表4．2可知，水解酪蛋白的添加总体来说增加了其褐化率，变化幅度不大。最大的褐化率是相比较于培养基3在28．3％的基础上增加到了28．5％。不同培养基诱导出的愈伤组织类型多样，符合愈伤组织3种类型的概括。1号培养基下诱导出的愈伤组织致密、颗粒状的良好愈伤组织，利于增殖与分化(附图3)；而2号和3号培养基诱导的愈伤组织约一半为为良好松脆颗粒状，另一半为疏松水化，不易增殖；4号培养基即未添加6-BA的培养基下诱导出的愈伤组织量少，且多疏松(附图4)。水解酪蛋白的添加使得良好的愈伤组织比例增加，且水化的相对的减少。总体来说水解酪蛋白的添加改善了杜若的愈伤组织的质量。综上所述，杜若茎段带节芽愈伤组织诱导的最适宜的培养基为5号培养基，即：MS+2,4．D1mg．L‘1甘寸AA0．5mg·L。1+6．BA1mg·L-l+CH(水解酪蛋白)500mg-L～。此时的愈伤组织诱导率达到了65．5％，为最高，其中良好的愈伤组织诱导率为63．3％，褐化率为26．3％，此时的愈伤致密、颗粒状，易增殖分化培养，可利用率高。 杜若抗旱性、耐荫性及其组织培养的研究第五章结论与讨论5．1结论本文通过查阅有关杜若的参考文献并进行相关实验所测出的各项数据，经过数据整理与分析得出的结论如下：(1)、抗旱性。本实验在对杜若进行不同天数的干旱胁迫时，以杜若植株生长形态、叶片保水力、土壤相对含水量、电导率、叶绿素含量以及各种酶活性含量等一系列指标，对杜若进行抗旱性研究。结果表明：①、当抗旱性实验进行20d后，杜若植株的叶片形态出现浅绿带黄、卷曲、萎蔫等现象，半数植株死亡；②、干旱胁迫初期，叶片失水率较快，说明干旱胁迫严重影响着杜若的叶片保水力；③、干旱胁迫对土壤含水量的变化有较大的影响。④、干旱胁迫处理开始5d以后，杜若的相对电导率随着干旱胁迫时间的延长而上升；⑤、干旱胁迫处理第5d时，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b的含量均出现拐点，5d之后开始呈降低的趋势。⑥、SOD与POD的活性变化的趋势大体相同，均为先略微波动后大量增长再快速减少，在干旱胁迫初期(5．10d)’出现高峰拐点。⑦、MDA含量变化呈现先上升后下降再上升的趋势，在干旱胁迫第5d出现高峰拐点。⑧、可溶性蛋白的含量呈现出先略微下降后上升再下降的趋势，在5．10d这一时段出现最高峰。以上实验结果表明杜若只可在短时间的干旱缺水环境下生长，但干旱胁迫5d以后，各项指标的变化都显示出杜若不可在长时间的干旱条件下正常生长。(2)、耐荫性。通过对杜若植株进行遮荫性实验，表明：①、在不同的遮荫梯度下，全光照条件下的杜若植株形态发生了很明显的变化，少数植株出现死亡现象，在其它3个遮荫梯度下，杜若都能很好地生长，说明杜若适合在遮荫环境下正常生长。②、由杜若的光合日变化曲线得出，杜若诤光合速率日变化曲线的类型为双峰型。9：00的净光合速率峰值要明显高于17：00的峰值。各遮荫处理下的诤光合速率都大于对照，且遮荫梯度75％的杜若光合速率最大；③、实验处理90d后，遮荫梯度75％下的叶绿素含量最多；在对叶绿素荧光的测定中，和其它遮荫处理相比，遮荫梯度75％情况下Fm、Fv、Fv／Fo、Fv／Fm、qP的值最大，Fo和NPQ的值最小。对照的Fo和NPQ值都大于经过遮荫处理的，但Fm、Fv、Fv／Fo、Fv／Fm、qP的值都小于遮荫处理的；④、耐荫实验经过90d后，POD活性和可溶性蛋白含量均为遮荫梯度75％情况下出现最大值，而且对照的POD活性和可溶性蛋白含量都要小于遮荫处理的。在MDA含量中，遮荫梯度为90％的在所有处理中数值最小，75％排第三位。通过以上的数据可知，杜若适合在弱光照的环境下生长，这也与杜若本身就具有较强耐荫性的生态特征相符合。(3)、组织培养。杜若茎段带节芽愈伤组织诱导的最适宜的培养基为5号培养基， 第五章结论与讨论即：MS+2,4．D1mg·L。1时寸AA0．5mg·L。1+6．BA1mg·L’1+CH(水解酪蛋白)500mg·L～。此时的愈伤组织诱导率达到了65．5％，为最高，其中良好的愈伤组织诱导率为63．3％，褐化率为26．3％，此时的愈伤组织致密、颗粒状，易增殖分化培养，可利用率高。5．2讨论本文对杜若抗旱性、耐荫性、组织培养做出了相应的研究，通过这些初步的研究所得出的数据及结论，可以为园艺师将杜若在园林绿化中进行合理地配植提供相关资料。杜若的园林应用大致分为以下几种。林下配植：在对杜若进行野外调查时，发现在竹林下生长着很多杜若植株，从远处望去，层次感很强，在树林下适宜种植杜若，再经过合理地栽培，可丰富景观的多样性(附图5)。林缘配植：杜若种植在林缘，可与其它草本植物或灌木紧密连结，使植物配植的层次感更强，形成更好的地被。花境配植：杜若叶片宽大鲜绿，从远处看上去非常吸引游人，是良好的夏季观叶植物。因此，杜若在园林配置上可以作为花境植物，与花境内其它植物合理搭配种植，给人心情愉悦的感觉(附图6)。滨水配植：杜若是荫生植物，喜潮湿的环境，在滨水区域的水杉林下种植，可以丰富水边的景观效果。但本文对杜若的研究只是初步的，加上本文作者的能力有限，没有做更深一步地研究。此外由于实验进行的时间比较紧，研究条件不是很完善，以及天气情况也不是很理想，这些外界因素可能会对实验造成一些影响，增大了实验的误差。所有这些有待今后进一步研究。 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致谢本论文是在导师何云核教授的悉心指导下完成的。从论文的选题、设计至撰写、修改和定稿，导师倾注了大量的心血。在三年的读研期间内，导师循循善诱、诲人不倦的工作方法、严谨求实的科学态度、勤奋进取的工作作风给了我深远的影响，引导我在人生的道路上乐观进取。在此，我首先向我的导师何云核教授表示衷心的感谢和最崇高的敬意!感谢师母三年来在我的生活和学习上对我无微不至的关心和照顾!感谢浙江省现代森林培育技术重点实验室为本论文研究提供的试验条件和技术支撑。感谢我的同门张亮亮，吴君以及研究生同学张涛，吴兴波等在我实验的进行过程中所付出的辛勤劳动，是他们的竭力帮助才使我的实验得以顺利进行。还要感谢室友张亮亮和邓磷曦在生活上对我的关心和照顾。感谢我亲爱的家人，感谢你们为我的成长付出了辛勤的劳动和汗水，始终是我的坚强后盾，因为有你们的支持与鼓励，才使得我克服种种艰辛与困难并顺利完成学业。谨以此文，献给所有关心、爱护和帮助过我的老师、同学和朋友，衷心的谢谢你们149