抗细菌fabb蛋白单克隆抗体的制备及fabb在不同菌种中的分布和差异研究

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1、抗细菌FabB蛋白单克隆抗体的制备及FabB在不同菌种中的分布和差异研究．PreparationofmonoclonalantibodyagainstproteinFabBandanalysisofthedifferenceanddistributionofFabBindifferentbactieriaspecies研究生：钱文正导师：金文杰副教授秦爱建教授资助项目：国家自然科学基金青年科学基金项目(30800822)教育部创新团队项Jj(IRT0978)江苏省青蓝工程计划江苏省优势学科项目扬州大学2013年6月钱文正：细菌FabB蛋白单克

2、隆抗体的制备及蛋白分布和差异研究抗细菌FabB蛋白单克隆抗体的制备及FabB在不同菌种中的分栅差异研究＼珊嬲研究生：钱文正导师：金文杰副教授秦爱建教授摘要细菌脂肪酸的合成属于II型脂肪酸合成酶系，与高等哺乳动物的I型脂肪酸合成酶系有差别，II型脂肪酸合成酶系的每一步催化反应都是由独立的酶完成的。大肠杆菌的脂肪酸合成由FabB、FabF、FabH、FabG、FabZ和FabA等酶来完成，FabB和FabF有缩合丙二酸单酰ACP与脂酰ACP的功能，从而完成碳链的延伸。大肠杆菌合成不饱和脂肪酸需要FabB蛋白的参与，催化不饱和脂酰ACP的从头合成，

3、产生顺．9一十六烯脂酰ACP。还有研究表明，FabB和FabF在细菌应对外界温度改变时发挥作用，这与细菌细胞膜的流动性相关。细菌脂肪酸合成存在多样性，这也为针对病原细菌筛选专一性的抗菌药物提供了可能。本研究根据GenBank上已发表的大肠杆菌历6B基因序列设计针对FabB蛋白全长的特异性引物，PCR扩增鹅源大肠杆菌G8107株．．幺船基因，获得大小正确的目的片段，克隆到pET-32a(+)表达载体中，经酶切鉴定，测序分析，获得重组质粒pET-32a-fabB，转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。转化成功的细菌在28。C经IPTG诱导

4、表达4小时，经过SDS．PAGE分析证明，含重组质粒的重组菌能够表达分子量为62KD左右的融合蛋白。表达产物通过镍柱纯化后得到纯度很高的目的蛋白。这为我们制备抗FabB单克隆抗体提供了很好的基础。取纯化的融合蛋白His—FabB免疫BALB／c小鼠，在检测到小鼠已产生针对FabB融合蛋白的阳性血清后，进行细胞融合，细胞培养一定时间后包被融合蛋白和His标签蛋白来进行筛选，筛选出能产生针对融合蛋白而非标签蛋白的抗体的细胞培养孔，进行亚克隆，扬卅1人学硕：l=学位论文最后得到4株抗大肠杆菌FabB蛋白的IgGl单克隆抗体，并用这4株杂交瘤细胞制备

5、腹水。单克隆抗体可以特异性地识别FabB蛋白，这为我们后续进行不同种属细菌中FabB蛋白的检测奠定了基础。根据上述实验目的利用制备好的单克隆抗体检测不同种属细菌是否存在FabB蛋白，首先用Westem．blot的方法检测到一些常见细菌中含有该蛋白，然后用PCR的方法验证，最后间接免疫荧光检测都得到同样的结果，也验证了FabB存在于细胞质中。通过测序和GenBank上下载向6B基因序列比较不同种属细菌该蛋白的序列差异和同源性，分析它们之间的异同。结果显示大肠杆菌(埃希氏菌属)、沙门氏菌、柠檬酸杆菌、克雷伯杆菌、志贺氏菌、肠杆菌(肠杆菌属)和耶尔

6、森菌含有FabB蛋白且同源性相近，虽然序列上仍存在一些差异但活性位点都相似。这些细菌都属于肠杆菌科，这也许和肠杆菌科细菌的生长特点有关系。为研究FabB对细菌是否发挥关键作用以及为后续实验奠定基础，应用Red／ET同源重组技术对目的基因向6B进行敲除，同时以敲除ompA基因作为对照。根据大肠杆菌。庙6B基因、ompA基因和FRT-flankedPGK．gb2一Ileocassette卡那霉素抗性片段设计两对含50bp同源臂的引物分别扩增该片段。利用电转化的方法先后将pRedET质粒和PCR扩增的含同源臂的抗性片段转入大肠杆菌G8107感受态细

7、胞，pRedET质粒能表达重组酶使进入细菌的抗性片段能识别靶基因发生同源重组。结果我们用卡那霉素抗性平板筛选到了ompA缺失菌株并且PCR鉴定正确，但相同条件下没有得到廊6B缺失菌株。这可能因为．廊6曰为细菌生长必须基因，缺失整段基因可能使细菌不能在普通条件下生长。关键词：脂肪酸合成酶系：FabB：抗菌药物：同源性分析；同源重组2钱文正：细菌FabB蛋白单克隆抗体的制备及蛋白分布和差异研究3PreparationofmonoclonalantibodyagainstproteinFabBandanalysisofthedifferencean

8、ddistributionofFabBindifferentbactieriaspeciesM．SCandidate：WenzhengQianSupervisor：