抗人cd40单克隆抗体免疫纳米载药胶束的制备及其生物学特性的研究

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1、硕士学位论文论文题目抗人CD40单克隆抗体免疫纳米载药胶束的制备及其生物学特性的研究研究生姓名郑毅指导教师姓名张学光专业名称免疫学研究方向肿瘤免疫论文提交日期2013年5月抗人CD40单克隆抗体免疫纳米载药胶束的制备及其生物学特性的研究中文摘要中文摘要前言抗人CD40分子治疗性单克隆抗体作为肿瘤生物治疗的一项重要手段，在对实体瘤、淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗中具有其独特的作用。5C11是本研究所自行研制的激发型抗人CD40单抗。前期研究表明，5C11在体外具有诱导骨髓瘤细胞凋亡，并增加化疗药物对某些肿瘤细胞敏感性的作用。因此，该抗体具

2、有潜在的治疗性应用价值，有望与免疫佐剂联合应用并配合化疗药物，更好地发挥抗肿瘤作用。纳米载药体系具有微小的体积、水溶液中良好的稳定性、广泛的载药范围、长时间的体内滞留、可通过被动靶向作用携带化疗药物到达肿瘤部位等优势，能有效克服单独使用化疗药物治疗所带来的局限性和毒副作用，可作为免疫佐剂的理想选择。本课题着眼于合成制备一种纳米载体，包载化疗药物，同时与抗人CD40单克隆抗体5C11相偶联，且不改变抗体的生物学活性，以达到兼具纳米载药体系和单抗靶向药物的优势，提高对肿瘤细胞的杀伤效果。目的：采用纳米聚合胶束为载体，制备包载阿霉素且偶联

3、5C11的聚合胶束，并对其体外细胞毒作用及细胞摄取进行评价。方法：合成一端含对甲苯磺酸酯基团而另一端聚合混消旋丙交酯的链段聚合物PLA-PEG-OTs作为成胶束（PMs）材料。溶剂挥发法制备阿霉素载药胶束（DOX-PMs）并偶联5C11形成阿霉素免疫载药胶束（DOX-PMs-5C11）。氢核磁共振波谱法与渗透凝胶色谱法检测胶束材料PLA-PEG-OTs结构及分子量。芘探针荧光光谱法检测PMs临界胶束浓度（CMC）。动态光散射法检测PMs粒径。四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测阿霉素（DOX）、DOX-PMs和DOX-PMs-5C11

4、对乳腺癌细胞毒作用。流式细胞仪、荧光酶标仪与激光共聚焦显微镜分别研究乳I中文摘要抗人CD40单克隆抗体免疫载纳米药胶束的制备及其生物学特性的研究腺癌细胞株上CD40分子表达情况,PMs与蛋白质连接率,PMs与5C11偶联活性及肿瘤细胞对DOX-PMs、DOX-PMs-5C11摄取情况。结果：氢核磁共振波谱法与渗透凝胶色谱法显示合成的各种不同亲疏水链比例的胶束材料PLA-PEG-OTs分子量分布在（4000~10000）g/mol间。它们形成的-3PMs的临界胶束浓度范围分布在（3.2~5.5）×10g/L间,粒径分布在（21.2~3

5、1.8）nm间，且偶联蛋白后粒径分布在（21.4~33.1）nm间。PMs与蛋白偶联反应最佳酸碱度为pH=8.5，此条件下PMs与BSA-FITC的偶联率为13.4%~17.1%。PMs能较好包载阿霉素并偶联5C11，其载药量与包封率分别为：(3.75±0.27)%、(75.12±2.38)%。MCF-7、MCF-7/ADR两株细胞上CD40的表达率为54.5%、73.6%。DOX-PMs-5C11对乳腺癌细胞的细胞毒效果均好于DOX-PMs及DOX，尤其在MCF-7/ADR细胞株中较为显著（P<0.05）。PMs偶联5C11抗体后

6、能促进肿瘤细胞对PMs的摄取。结论：阿霉素免疫载药胶束能通过增加肿瘤细胞对阿霉素的摄取,进而增强阿霉素对肿瘤细胞的毒性。该作用在CD40表达较高的耐阿霉素乳腺癌肿瘤细胞中发挥较为明显。关键词：CD40单克隆抗体；纳米载药胶束；肿瘤免疫治疗；阿霉素作者：郑毅指导老师：张学光II抗人CD40单克隆抗体免疫纳米载药胶束的制备及其生物学特性的研究英文摘要SynthesisandfunctionalresearchofmonoclonalantibodyagainsthumanCD40molecule5C11immunizedchemical

7、drugencapsulatedNanopolymericmicelleAbstractInstructionAsaspecialtumorbiotherapeuticchoiceoflymphoma,solidtumorandmultiplemyeloma,monoclonalantibodiesagainsthumanCD40moleculehavebeendrawingtheresearchers'attentionsinceitstherapeuticeffectshadbeenidentified.Thepreviouss

8、tudyresultshadshownthat5C11,akindofagonisticmonoclonalantibodyagainstCD40moleculeproducedbyourlaboratorycoulddefinite