广州管圆线虫感染免疫中icos-icosl通路及发育期蛋白的分析和研究

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1、博士学位论文论文题目广州管圆线虫感染免疫中ICOS-ICOSL通路及发育期蛋白的分析和研究研究生姓名黄慧聪指导教师姓名夏超明专业名称病原生物学研究方向寄生虫感染免疫论文提交日期2013.513广州管圆线虫感染免疫中ICOS-ICOSL通路及发育期蛋白的分析和研究中文摘要中文摘要研究背景：广州管圆线虫是一种人兽共患寄生虫。其幼虫阶段可侵入非正常宿主——人，引起中枢神经系统的病变。在感染免疫中抗原由抗原提呈细胞(APC)处理成多肽，它与MHC结合并移至APC表面，产生活化TCR信号；而APC或靶细胞表面的共刺激分子与T淋巴细胞表面

2、的有关受体结合就产生第二活化信号，即协同刺激信号。在双信号刺激下，T淋巴细胞被激活后转化为淋巴母细胞，并迅速增殖、分化。CD28-B7共刺激途径是研究最早最深入的共刺激途径之一,但CD28并不是惟一的共刺激分子。可诱导共刺激因子（inducibleco-stimulator,ICOS）为CD28家族的新成员，主要表达于活化的Ｔ细胞；其配体ICOSL主要表达于B细胞、单核细胞、树突状细胞和T细胞。此外，寄生虫需要通过改变宿主来完成其生活史，因此，他们有根据宿主环境来调节基因的差异表达的能力。广州管圆线虫生活史的完成需要几个不同的

3、宿主。Ⅲ期幼虫（L3）感染大鼠后，穿过血脑屏障发展成Ⅴ期幼虫（L5），再移行至心、肺部血管内发育成成虫。本研究首先应用ICOSL-KO和C57BL/6J两种小鼠建立广州管圆线虫感染的模型，观察ICOS-ICOSL信号通路在广州管圆线虫感染免疫调节中的意义；其次，运用双向荧光差异凝胶电泳和质谱相结合的蛋白质组学技术分析鉴定广州管圆线虫发育期特异性蛋白质并分析他们在宿主-寄生虫相互作用中的意义。本研究结果可为广州管圆线虫感染的发展和消退研究提供新的思路，还为广州管圆线虫病的治疗提供可能性靶标。第一部分ICOS-ICOSL信号通路在

4、广州管圆线虫感染免疫调节中的意义目的：通过观察两种广州管圆线虫感染宿主模型（ICOSL-KO和C57BL/6J）血清抗体、脾淋巴细胞表面协同刺激因子及脾淋巴细胞分泌细胞因子的动态变化，I中文摘要广州管圆线虫感染免疫中ICOS-ICOSL通路及发育期蛋白的分析和研究探索ICOS-ICOSL信号在广州管圆线虫感染免疫调节中的意义。方法：实验室条件下构建广州管圆线虫感染的ICOSL-KO和C57BL/6J小鼠模型。分别于感染前、感染后1周、2周、3周、4周，分批处死小鼠每批每组各取5只小鼠，眼眶取血，收集血清，ELISA法测定血清中

5、IgG、IgG1和IgG2a的水平。同时分离不同感染时期小鼠脾淋巴细胞悬液，流式细胞仪测定CD4+T淋巴细胞上CD28、CD154和ICOS的表达，其结果用SPSS17.0采用t检验和F检验分析其统计学意义。体外培养脾CD4+T淋巴细胞。加入广州管圆线虫L5可溶性抗原干预共刺激信号。培养72小时后，收集细胞上清。ELISA法测定上清中IFN-γ、IL-12、IL-4、IL-5和IL-13等细胞因子表达水平。结果：ICOSL-KO组与C57BL/6J组在感染后均表现为IgG抗体水平的升高；前者IgG1水平在感染后升高不显著，但后

6、者的IgG1水平相对在感染后3W开始出现升高，4W时仍维持升高；同时C57BL/6J小鼠的IgG2a水平在感染后升高不显著，并于3W开始出现下降，反观ICOSL-KO小鼠IgG2a水平在感染后3W开始出现升高，4W时仍保持升高状态。ICOSL-KO组与C57BL/6J组相比IgG1动态趋势及IgG2a水平升高趋势，显示ICOS-ICOSL信号通路的阻断通过抑制Th2的极化使宿主无法组织产生有效的体液保护性免疫，ICOSL-KO小鼠表现为Th1的的免疫类型占优势。感染后ICOSL-KO组的CD4+T淋巴细胞上协同刺激分子产生也明

7、显滞后，感染后3W才出现显著性差异；C57BL/6组针对广州管圆线虫急性感染，感染后1W即出现显著性差异。C57BL/6J组感染早期出现IFN-γ、IL-12增高现象，而后下降，提示感染2W内Th1免疫应答水平占优势，随之逐渐被Th2免疫应答水平取代；而ICOSL-KO组Th1型细胞因子IFN-γ、IL-12的早期不增高，表明ICOS-ICOSL信号通路也参与到感染免疫早期的Th1型免疫的活化过程。在感染早期Th2型细胞因子IL-4和IL-5受ICOS-ICOSL信号通路影响不大。IL-13在C57BL/6J小鼠感染后3W后出

8、现增高，IL-13在ICOSL-KO小鼠出现延后升高，两种动物感染模型动态检测的显著性差异，也说明了ICOS-ICOSL通路阻断对Th2型免疫应答水平的调控作用。结论：在广州管圆线虫的急性感染期，Th2型的免疫方式在免疫应答过程中占优势；ICOS-ICOSL通路调节作用既能延