tlr4基因对断奶仔猪f18大肠杆菌抗性调节机制的初步分析

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1、TLR4基因对断奶仔猪FIg大肠杆菌抗性调节机制的初步分析勉脚基因对断奶仔猪F18大肠杆菌抗性调节机制的初步分析研究生：刘璐导师：包文斌研究员吴圣龙研究员专业：动物遗传育种与繁殖(扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009)摘要F18大肠杆菌是一种产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli．，ETEC)，它可以通过菌毛粘附在小肠上皮细胞上，产生肠毒素，并在死亡溶解后释放内毒素脂多糖(Lipopolysaecharide，LPS)而引起仔猪腹泻、水肿、死亡，给养猪生产造成了巨大损失。目前研究发现，TLR4(

2、Tolllikereceptor4)是将LPS的刺激信号直接传入细胞内的一种最重要的跨膜模式识别受体(Patternrecognitionreceptor，PRR)。TLR4主要通过识别LPS，经髓样分化因子(Myeloiddifferentiation#maryresponseprotein88，MyD88)蛋白与白介素1类受体(Interleukin一1receptor，IL一1R)信号转导途径重合，最终导致核转录因子(Nuclearfactorzb，NF．1cB)的激活，引起各种炎症因子基因表达，促使F18大肠杆菌引起仔猪腹泻和水肿。鉴

3、于TLR4在机体天然免疫与特异性免疫的关键环节发挥的重要作用，本试验将其作为猪抗病育种的候选基因进行研究，从DNA、mRNA和细胞水平对猪TLR4基因的功能进行探讨和分析，主要结果如下：1．采用PCR．SSCP方法对亚洲野猪、3个引进的商业化品种和10个中国地方猪品种共893个个体TLR4基因外显子1的遗传变异进行了检测，旨在系统分析国内外猪种TLR4基因的多态性，为探讨该基因在免疫和防御系统中发挥的作用提供依据。结果，在猪TLR4基因外显子1中分离到新的突变位点，共检测到3个等位基因，6种基因型。其中杜洛克检测到AA、BB、CC、AB、AC

4、、BC基因型，有杜洛克血统的苏太猪中检测到BB、CC、BC基因型，长白猪、约克夏中检测到CC、BC基因型，野猪及所有lO个中国地方猪品种TLR4基因外显子l高度保守，只检测到CC基因型，中国地方猪品种和引进品种TLR4基因外显子l多态性存在极显著的差异。3种基因型中CC型与2扬州大学硕士学位论文GenBank中的序列一致，BB型为G93C同义突变，而AA基因型存在G194A同无义突变位点，这2个变异位点与个体抗逆性和一般抗病力的关系值得进一步深入研究。2．用实时荧光定量PCR法检测TLR4的组织表达谱及其在苏太猪FIB大肠杆菌抗性型群体和敏感

5、型群体的表达差异，结果表明：TLR4基因在所检测的仔猪11个组织中均表达，在肺、淋巴结、。肾脏和脾脏等免疫器官中表达量较高，在肺中表达量最高；在F18大肠杆菌抗性群体和敏感性群体中，F18大肠杆菌敏感型个体的TLR4基因表达量普遍高于抗性型个体的表达量，在各个组织中(除胃外)TLR4表达量差异倍数从1．171到2．598不等，表明，TLR4基因通过固有免疫识别机制，对猪F18大肠杆菌等革兰氏阴性疾病有一定的影响，TLR4基因表达量的下调与F18大肠杆菌的抗性具有一定程度的关系。3．利用LPS诱导猪小肠上皮细胞，检测TLR4／MyD88信号通路

6、基因的表达变化，0．1I．tg／mLLPS刺激IPEC后，TLR4、CDl4、MyD88、TNF-a、IL．邛和IFN-a的表达量都极显著升高(P<0．01)，并在刺激后的2、4、6小时呈阶梯增长；lrtg／mLLPS刺激IPEC后，TLR4、CDl4、MyD88、TNF-a、儿一邶和IFN-a都明显升高且差异极显著(P<0．01)，并在刺激后的4到6小时间增长显著。实验表明，在IPEC中，TLR4参与LPS激发的固有免疫应答机制，这一免疫通路将促进F18大肠杆菌的致病性，因此TLR4基因是猪F18大肠杆菌抗性育种的重要功能基因。关键词：TL

7、R4、F18大肠杆菌、多态性、表达差异、TLR4介导的信号通路、仔猪TLR4基因对断奶仔猪F18大肠杆菌抗性调节机制的初步分析3PreliminaryAnalysisofTLR4GeneRegulationMechanismResistingtoE．coliF18inWeaningPigletsAbstractIntheswineindustry,EcoliF18isorleofthemostprevailandharmfulEnterotoxigenicEscherichiacoli(ETEC)，whichalwaysadheretothe

8、smallintestineepithelialcellsbyitspili．Moreover,theproductofit,intestinotoxin，canc