pink1蛋白磷酸化修饰帕金森病发病机制中的作用研究

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1、中图分类号堡二!UDC占

2、0博士学位论文学校代码iQ§≥圣密级公珏PINKl蛋白磷酸化修饰在帕金森病发病机制中的作用研究TheresearchonphosphorylationofPINKlproteininthepathogenesisofParkinson’sdisease作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：论文答辩日期2尘!：!答姚凌雁临床医学神经病学中南大学湘雅医院唐北沙教授．獭会主避辩委员会主席l芝!§中南大学二零一三年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方

3、外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：垃企日期：!里年三月!日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。日期：旦年—三月三二日博士学

4、位论文中文摘要PINKl蛋白磷酸化修饰在帕金森病发病机制中的作用研究中文摘要摘要背景：帕金森病(Parkinson’Sdisease，PD)是临床上常见的神经退行性疾病之一。PD的临床表现主要为静止性震颤、运动迟缓、步态异常和肌强直，PD的病因与发病机制尚无确切定论，主流研究认为这是一种与衰老、环境及遗传因素密切相关的疾病。PINKl基因(PTEN．inducedputativekinase1)是在2004年被克隆的PARK6致病基因，属于常染色体隐性遗传早发性帕金森综合征的致病基因之一，该基因编码产生一种由581个氨基酸组成有激酶活性的线粒体蛋白，包括一个由34个氨基酸组成的线粒

5、体定位结构域和一个由354个氨基酸组成的激酶结构域，此激酶结构域与Ca2+／钙调蛋白家族的丝氨酸／苏氨酸激酶高度同源。PINKl蛋自首先于2003年被证明它的激酶区域在体外实验中有自磷酸化活性，PINKl蛋白能通过自身磷酸化后，调节其自身的激酶活性：PINKI蛋白也能参与体外磷酸化，如磷酸化组蛋白H1或酪蛋白。有研究发现PINKl基因的致病突变影响了PINKl蛋白的磷酸化。但未有PINKl蛋白自身磷酸化位点体外实验的鉴定研究报道，及PINKl蛋白的自身磷酸化修饰位点改变对其体外激酶活性影响研究报道。在前期工作中我们发现了两种PINKl基因新的纯合致病突变(T313M，IⅥ92X)，

6、两者均位于激酶结构域中，从而导致其激酶功能改变，也可能对稳定PINKl蛋白的结构起重要作用，这两种致病突变的致病机理仍有待探讨。目的：探讨PINKl蛋白自磷酸化修饰功能及磷酸化底物功能参与博士学位论文中文摘要帕金森病致病的机制方法：1、应用谷胱甘肽亲和层析法纯化法、体外磷酸化和质谱技术鉴定PINKI蛋白的自身磷酸化修饰位点；2、应用体外磷酸化和放射自显影技术明确PINK!蛋白的自磷酸化修饰位点：3、应用体外磷酸化和放射自显影技术检测P肿￡1的自磷酸化修饰位点突变、T313M、R492X突变对PINKl蛋白的激酶活性的影响；4、应用脂质体过表达、细胞免疫荧光化学染色的方法检测自磷酸化

7、修饰位点对PINKl在真核细胞中的亚细胞定位的影响；5、应用脂质体过表达、chase-time技术研究自磷酸化位点突变对PINKl自身降解的影响；6、应用脂质体过表达、细胞免疫荧光化学染色的方法检测PINKl自磷酸化修饰位点突变、T313M、R492X突变PINKl对ParkinqE_细胞定位的影响。结果：1、质谱结果显示一个PINKl蛋白可能的自身磷酸化位点：PINKl第465位丝氨酸残基一Ser465，通过生物信息比对可知，该氨基酸残基在绝大多数种属中高度保守。2、放射自显影结果示：在体外磷酸化条件下，野生型PINKl蛋白能够被自身磷酸化，而$465A突变型PINKl蛋白自身磷

8、酸化水平较野生型降低，两者的差异具有统计学意义(P<0．05)。3、放射自显影结果示：在体外磷酸化条件下，野生型PINKl蛋白能够磷酸化酪蛋白(casein)，而T313M、R492X、$465A突变型PINKl蛋白磷酸化底物水平较野生型降低，三种突变型PINKl蛋白分别与野生型PINKl蛋白进行两两比较的差异均具有统计学意义(P<0．05)。博士学位论文中文摘要4、HEK293细胞免疫荧光化学染色结果显示：野生型PINKl蛋白分布于细胞胞质，呈典型的点状分布的线粒体