大肠埃希菌ampc基因lamp检测方法的建立及其初步应用

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1、南方医科大学201O级硕士学位论文大肠埃希菌ampC基因LAMP检测方法的建立及其初步应用EstablishmentandapplicationofLAMPmethodfordetectionofampCgeneinE．coli课题来源：广州市科技计划重大专项(20lOUl．E00611)学位申请人张志远导师姓名龙北国教授范宏英讲师专业名称病原生物学培养类型学术型培养层次硕士研究生所在学院公共卫生与热带医学学院2013年5月31日广州硕士学位论文大肠埃希菌ampC基因LAMP检测方法的建立及其初步应用硕士研究生：张志远指导老师：龙北国教授范宏英讲师摘要

2、一、研究目的和背景近年来，细菌耐药性已成为一个严重的公共卫生危机，它可导致患者治疗的失败、医疗费用的增加和病死率的上升，更为严重的是，细菌耐药性的进一步发展，可能使人类重新面临感染性疾病无药可治的威胁。世界卫生组织(WHO)最近警告说，如果人类不能尽快采取有效行动，细菌耐药性危机将全面来临。目前，几乎所有的抗生素都有相应的细菌产生耐药性，其中，D．内酰胺酶引起的细菌耐药最令人担忧。p．内酰胺酶已经从初始的普通酶演变成为广谱酶、超广谱酶(ESBLs)、碳青霉烯酶等，临床亦发现对所有D．内酰胺类抗菌药物耐药的大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等。AmpC酶是一类主要

3、由肠杆菌科细菌、枸橼酸杆菌、铜绿假单胞菌等产生的p．内酰胺酶，它能水解青霉素和第一代、第二代、第三代头孢菌素，以及单环类B．内酰胺类抗生素，且大多引发多重耐药。近年来，随着头孢菌素类及p．内酰胺类抗生素的广泛使用，AmpC酶的临床检出率不断攀升，已成为革兰阴性杆菌产生耐药性的主要原因。AmpC酶的合成与ampC、ampR、ampD、ampE、ampGTz种基因有关。其中ampC基因是AmpC酶的结构基因，大多存在于细菌的染色体上，部分也可存在摘要于质粒上，能编码由380个氨基酸组成的、分子量为39．6KDaI拘AmpC酶。与染色体介导的AmpC酶不同，

4、质粒介导的AmpC酶大多为持续高产型AmpC酶，其产生亦无需抗生素的诱导，并且耐药基因可迅速传播到不同的菌属和菌种，为耐药危机的暴发埋下隐患。目前，AmpC酶的检测方法主要有两类：一是粗提耐药细菌的AmpC酶做药敏试验进行检测，主要有头孢西丁(FOX)敏感试验、AmpC酶表型筛选试验、氟氯西林(FCC)双纸片扩散协同实验、三维试验等；二是对编码AmpC酶的基因进行检测。直接针对AmpC酶进行检查的试验可靠性较高，但一般需要提取酶的粗提物，操作繁琐、比较费时，难以在大多数临床微生物实验室常规应用。AmpC酶的基因检测是利用分子生物学方法测定待检细菌[1b

5、AmpC酶的基因序列，其结果准确，但需严格防止因污染造成的假阳性或假阴性结果。环介导等温扩增(100p-mediatedisothermalamplification，LAMP)是日本学者Notomi等建立的一种新的核酸检测技术。其特点是针对靶基因的6或8个区域设计4或6条特异性引物，利用链置换DNA聚合酶(BstDNApolymerase)在等温条件(65℃左右)下保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。LAMP具有简单、快速、特异性强的特点，与常规PCR相比，不需模板的热变性、温度循环等过程，也不依赖任何专门的仪器设备，可以实现现场的快速检测。该技术在

6、灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，检测成本远低于荧光定量PCR，适于大规模样品的检测和基层单位推广应用，现已广泛应用于疾病诊断、病原微生物检测以及动物胚胎的性别鉴定等诸多领域。LAMP的反应体系主要包括DNA模板、引物(包括内引物、外引物和环引物)、甜菜碱、dNTPs、M92+、BstDNA聚合酶、Bstbuffer等。为了实现LAMP对目的基因的准确检测，须对反应体系进行优化，探索体系中各种成份的最佳浓度，并对灵敏度和特异性进行评估。由于LAMP具有很高的灵敏度，故应采取适当的措施防止污染，以防产生假阳性结果。大肠埃希菌是目前

7、引起医院感染的首位致病菌，从我国医院对细菌耐药监II硕士学位论文测结果来看，大肠埃希菌的耐药检出率在逐年升高。特别是近十多年来，随着广谱13．内酰胺类抗生素，尤其是第三代头孢菌素的广泛使用，产AmpC酶的大肠埃希菌日益多见。AmpC酶的产生使大肠埃希菌对大量抗生素产生耐药性，通常包括青霉素和除头孢匹罗和头孢吡肟以外几乎全部的头孢菌素类药物。另外，产AmpC酶的大肠埃希菌也可能伴有ESBLs的产生，从而产生耐广谱头孢菌素的现象。同时产ESBLs和AmpC酶的大肠埃希菌通常还会携带其他的耐药基因，这将导致临床治疗更加困难，甚至导致严重的耐药性危机。建立适合

8、临床应用的产AmpC酶细菌筛选体系和了解产AmpC酶细菌的流行情况是制定有效防治对策的前提。本