致泻性大肠埃希菌的基因检测和方法学研究

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1、温州医学院硕士学位论文致泻性大肠埃希菌的基因检测和方法学研究姓名：徐琦煜申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：周铁丽；李超2012-05-12温州医学院硕士学位论文致泻性大肠埃希菌的基因检测和方法学研究摘要目的1．了解温州医学院附属第一医院2009年6月～2011年8月临床分离肠道致病菌的感染情况，探讨传统的实验室方法在肠道致病菌中的应用利弊。2．研究血清型0157：H7在改良山梨醇麦康凯平板(CT．SMAC)上的生长情况，探讨CT—SMAC平板应用的可行性。3．研究致泻性大肠埃希菌EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EaggEC等

2、的毒力相关基因，建立一种同时检测五种致泻性大肠埃希菌的多重PCR方法，为临床检测、分型与鉴定致泻性大肠埃希菌(DEC)提供特异、敏感、快速的检验方法。方法1．根据《全国临床检验操作规程》第三版采用传统的实验室方法：分离培养+生化试验鉴定+血清分型来统计分析温州医学院附属第一医院2009年6月至2011年8月分离到的800份粪便标本中的肠道致病菌的分布情况。2．改良山梨醇麦康凯平板(CT．SMAC)检测肠出血性大肠埃希菌血清型0157：H7的生长情况。3．采用单一PCR和多重PCR(mPCR)方法检测标本中的bfpA、eae、eltA、eltB、i

3、paH、stxla、stxlb、stx2a、stx2b、hlyAO、hlyAP、aatA等的毒力基因。4．对基因阳性菌株进行DEC的归类，并对基因产物进行测序分析，并将测序比对结果与血清学检测结果进行比较评价。结果1．800份粪便标本中，用传统的实验室方法共分离病原菌66株(8．25％)，其中沙门菌属15株(1．88％)，志贺菌属1株(0．13％)，副溶血弧菌20株(2．50％)，其他致病菌如金黄色葡萄球菌、肠球菌、弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、白假丝酵母菌等共30株(3．75％)。3温州医学院硕士学位论文2．800份

4、粪便标本中运用改良山梨醇麦康凯琼脂平板(CT—SMAC)法共检得0157：H72例。其在CT．SMAC平板上过夜培养后形成边缘蓝色、中心呈灰褐色的菌落，并且与0157：H7血清学凝集。3．800份粪便标本中，用多重PCR方法共分离到DEC49株(6．1％)，占全部病原菌构成比的42．2％(49／115)。检出基因型为myAO15株，HlyAP13株，eltA、eltB6株(该6株为同一血清型菌株)，eae8株，aatA5株，bfpAl株，ipan1株。4．在49株DEC中，EHEC分离最多28株(57．1％)，其次为EPEC9株(18．4％)，E

5、TEC6株(12．2％)，EaggEC5株(10．2％)，EIEC1株(2％)。5．对PCR扩增为阳性的扩增产物进行测序比对后显示，本研究所测得的所有基因GenBank序列数据库的已知序列同源性均在98．3％以上。6．49株DEC中，EHEC分属5种不同血清型，其中0157：H7检到最多(10株)；EPEC分属4种不同血清型；ETEC分属4种不同血清型；EaggEC分属3种血清型；EIEC仅1种血清型。结论1．传统的实验室方法可较好检出沙门菌、志贺菌以及其他肠道致泻菌，但是对于致泻性大肠埃希菌来说，用经典或传统的分离培养方法不足以检测除EHEC的

6、0157：H7之外的其他EHEC的血清型和DEC的其他类别，极易造成漏诊。2．改良山梨醇麦康凯平板培养基(CT—S心)可以作为分离EHEC0157：H7的鉴别培养基，虽然其特异性高，但是敏感性较低。尚需要敏感度更高的方法来鉴定。3．多重PCR方法具有相对较高的阳性率，它不仅可以检测EHEC0157：H7，同时也可以检测EHEC的其他血清型和其他DEC，故多重PCR方法作为感染性腹泻病原菌的检测具有良好的应用前景。4．DEC的分离率较高(6．1％)，是急性腹泻的主要病原菌(占病原菌构成比的42．2％)。至少存在17种O血清型，5类DEC都有各自的比

7、较特定的血清型，可用于初步分型。DEC菌株携带的毒力相关基因呈现多样性，一些血清型具较高的基因携带率。关键词肠道致病菌致泻性大肠埃希菌多重PCR毒力基因血清型4温州医学院硕士学位论文GenomeDetectionandMethodolo酊ResearchofDiarrheicEscherichiacoilfromClinicalSpecimen．Abstractobjective1．Toinvestigatetheinfectionofintestinalpathogensfromtheclinicalspecimenofthefirstaffi

8、liatedhospitalofWenzhouMedicalCollegeandtoevaluatetheadvantagesanddi