拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者中新发现hbv逆转录酶rtm204q变异株病毒学特点的研究

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1、独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日----------------------------------------------------------学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解桂林医学院有关保留、

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3、……1ABSTRACT…………………………………………………………6符号说明………………………………………………………………12前言……………………………………………………………………141材料与方法…………………………………………………………161.1研究对象……………………………………………………………161.2主要试剂……………………………………………………………161.3主要仪器……………………………………………………………171.4HBVDNA提取…………………………………………………171.5HBVRT全基因组巢式PCR扩增方法……………………

4、………181.6琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果……………………………201.7HBVDNA的克隆、鉴定及测序分析……………………………201.8定点突变改建pTriEx-1.1倍HBV重组质粒……………………241.9五种变异克隆株上RT区与改建成功的pTriEx-1.1-HBV（C）上的RT区置换克隆及鉴定………………………………………………281.10重组质粒转染HepG2细胞及加药培养………………………301.11变异病毒株的复制力测定及对药物敏感性实验……………302结果………………………………………………………………312.1PCR扩增目的样品

5、L107HBVRT区,TA克隆及其基因型分析…312.2改建的pTriEX-HBV(C)-1.1载体酶切鉴定与测序鉴定…………352.3HBV突变型与野生型的RT区与pTriEX-HBV-1.1倍载体上的RT进行置换……………………………………………………………362.4变异病毒复制力水平与表型耐药特点的鉴定………………373讨论………………………………………………………………40III4结论………………………………………………………………45参考文献……………………………………………………………46综述…………………………………………………………………5

6、1攻读学位期间发表的学术论文目录………………………………61致谢…………………………………………………………………62IV拉米夫定耐药慢性乙型肝炎患者中新发现的HBV逆转录酶rtM204Q变异株的病毒学特点研究中文摘要我国有9300万慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染人群，慢性HBV感染可引起慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌，我国每年死于HBV感染相关疾病的患者约35万人。抗HBV治疗是慢性乙型肝炎治疗及阻断其向肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌发展的重要手段，核苷（酸）类似物（nucleos(t)ideanalogs，NAs）是抗

7、HBV治疗的主要药物，但随用药时间的延长，病毒的耐药问题已成为临床抗HBV治疗的棘手问题。1998年上市的拉米夫定（lamviudine，LAM）在我国有长达13年的临床抗HBV治疗史，超过120万慢性乙型肝炎患者曾经应用LAM进行抗病毒治疗，由于该药服用方便、安全，治疗费用相对低等优点，目前仍有大量患者在服用该药。HBV多聚酶缺乏校对活性，因此在病毒复制过程中容易产生错配，产生大量序列多样性的病毒株，形成病毒准种。在药物选择压力下，对药物适应性强的病毒变异株可演变为优势株，引起病毒耐药。NAs的作用靶位在HBV多聚酶的逆转录酶（reversetransc

8、riptase,RT）区，抑制病毒的复制。引起病毒耐药的基因变异分