华南地区常见药用蛇类的dna条形码研究及其在金钱白花蛇鉴定上的应用

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1、南方医科大学2010级硕士学位论文华南地区常见药用蛇类DNA条形码研究及其在金钱白花蛇鉴定上的应用DNABarcodingCommonMedicinalSnakesinSouthChinaandItsApplicationinldentltiCatlonotJlnqlanBalnuaStaeT●●●■●t●■一●⋯●’⋯一●(BungarusParvus)课题来源：中国中医科学院中药研究所开放研究项目“中国药用动物DNA条形码研究"(MADNA201004)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次所在学院廖婧晁

2、志中药学全日制硕士研究生中医药学院2013年3月29日广州硕士学位论文华南地区常见药用蛇类DNA条形码研究及其在金钱白花蛇鉴定上的应用硕士研究生：廖婧指导教师：晁志摘要中药是中华民族的一大宝藏，在中国用于治疗疾病的历史已有数千年。中药来源于植物、动物、矿物三大类。动物药是中国医药宝库中重要的组成部分，具有悠久的应用历史。《中国药典》2005年版一部共收载药材553种，其中动物药53种，占9．6％，占可供药用动物资源的3．2％。我国利用蛇类的历史源远流长，可追溯至春秋战国时期。蛇类主要的利用方式为药用、食用和制革等

3、。常见的药用种类有滑鼠蛇Ptyasmucosus、乌梢蛇Zaocysdhumnades、银环蛇Bungarusmulticinctus、尖吻蝮Deinagkistrodonacutus等，食用的主要有灰鼠蛇Ptyasl∞rros、滑鼠蛇、舟山眼镜蛇Najaatra等，用于制革的有王锦蛇Elaphecarinata等。而乌梢蛇、银环蛇和尖吻蝮蛇分别是药典收载的生药乌梢蛇、金钱白花蛇、蕲蛇的原动物，具有祛风、通络、止痉之功效，临床应用比较普遍。近年来，蛇的药用价值和经济价值明显提高，社会需求持续上升。随着蛇类野生资源

4、逐渐匮乏，加上价格昂贵，药材市场上出现伪品及混淆品的数量甚多，质量问题严重，仅根据外部形态特征很难进行准确地鉴别。此外由于蛇类本身繁殖能力不强，加之生态环境易遭破坏，偷猎、走私与滥用导致多种蛇类特别是濒危蛇类的生存受到威胁。对蛇的准确鉴定，不仅能准确的鉴别药材正品来源与混伪品，保证用药的安全有效，也是加强蛇类资源保护与管理的首要环节。因此，建立快速、准确的鉴定方法具有重要意义。蛇类药材的混淆品屡见不鲜，鉴别方法也不断发展，除了传统的四大鉴别中文摘要方法(基源鉴别、性状鉴别、显微鉴别和理化鉴别)，许多新的鉴别技术和

5、先进仪器被引入蛇类药材的鉴别之中。DNA条形码(DNAbarcoding)技术是分子鉴定的最新发展，近年来在物种鉴定方面得到了迅速的发展和应用。DNA条形码技术简便高效，操作流程简单，而且不受样品的形态性状以及研究者的专业水平限制，尤其适用于来源于生物体部分组织或器官的中药材的真伪鉴定。中药DNA条形码分子鉴定在近几年得到快速发展，加快了中药鉴定标准化的进程。目前，动物DNA条形码技术最常用的基因片段是COI基因。国内已有用基于COI片段的DNA条形码对动物药鳖甲、鹿茸的鉴别应用进行了探索，均表明了其有效性。因此

6、，我们收集了国内常见药用蛇类，探讨应用COI条形码对蛇类识别鉴定的可行性，并分析物种间的亲缘关系。一．华南地区常见药用蛇类的DNA条形码研究1．目的本文拟收集华南地区常见药用蛇类20余种，建立华南地区常见药用蛇类的DNA条形码数据库，用于生药样品鉴定并分析物种间的亲缘关系。2．方法2．1标本采集从广东、广西、湖南等地采集和收集蛇类物种共3科23种蛇44个样品。经华南濒危动物研究所张亮鉴定，所有蛇类标本均固定保存在95％酒精中，组织置于．20。冰箱保存。本研究结合实验样本及GenBank数据进行分析。2．2引物设计

7、采用引物设计软件PrimerPremier5，设计对蛇类物种COI序列能有效扩增的引物。2．3DNA的提取及COI序列扩增1)采用动物基因组提取试剂盒对采集的动物标本提取总DNA，用1．2％琼脂糖凝胶电泳检测模板质量；II硕士学位论文2)对所提取的DNA的COI序列进行扩增，引物采用自行设计的双引物扩增。引物序列为：DKl-C01：5-‘CAACl：AACCACAAAGACATCGG’-3；DKl．C02：5．‘CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA’．3．反应体系25I．t1：包括模板DNA、正反引物(2

8、0umol／1)各1斗l，mix酶12．5肛l，双蒸水9．5ul。扩增程序：93。C预变性5min，53。C2min，循环35次，依次为93℃变性30s，53*C退火45s，70。C延伸45s，最后在70。C延伸补齐5min。2．4PCR扩增产物回收纯化及测序PCR产物用1．2％琼脂糖电泳检测后，置于紫外灯下进行呈像，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒(Axygen)回收。PCR