儿童腹泻相关的人博卡病毒2型的初步研究

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1、北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文博士学位论文学校代码：10023学号：B2010032002儿童腹泻相关的人博卡病毒2型的初步研究所院：姓名：指导教师：导师小组：学科专业：研究方向：完成日期：首都儿科研究所赵慧钱渊赵林清儿科学儿科病毒感染性疾病的病原研究2013年5月塑塑壁塑璧塑塑篁塑目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1ABSTRACT⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯．⋯．⋯⋯⋯⋯⋯4日U吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．8第一部分从急性腹泻儿童中检出人博卡病毒2型⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．10材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯lO实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．16讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．24第二部分人博卡病毒2型环状基因组的检出及其重组质粒的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯．27材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27实验结果⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．37讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．44小结⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．48综述一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯54综述二⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．85致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯87个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．88独创性声明与使用授权书⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯90北京协和医学院中国医学科学院博士学位论文中文摘要儿童腹泻相关的人博卡病毒2型的初步研究博士研究生：赵慧指导教师：钱渊白2005年瑞典科学家Allander等人首次在呼吸道感染患儿的鼻咽吸出物中发现人博卡病毒(Humanbocavirus，HBoV)以来，又

5、陆续发现了3个新的HBoV基因型别—-HBoV2～4。这些病毒属于细小病毒科(Parvoridae)细小病毒亚科(Parvovirinae)的博卡病毒属(Bocavirus)，是迄今发现的继细小病毒B19之后能感染人的第二类细小病毒。HBoV在世界各地均有报道，许多国家已经报道了在不同标本中(如呼吸道标本、粪便、血清等)检测出HBoVs，但绝大部分的研究是针对HBoVl，对HBoV2～4的研究报道还很有限。从现有的资料来看，越来越多的临床证据支持HBoVl为下呼吸道感染的致病病毒，而HBoV2--

6、一4主要在腹泻患儿的粪便标本中检出，这些感染肠道的HBoVs尤其是HBoV2在粪便标本中的检出率要高于其它基因型别，提示它们可能与儿童的急性胃肠炎有关。目前为止，HBoV尚不能体外培养，也无动物模型建立，阻碍了其复制机制及致病机理的研究。为揭示其复制机制，有研究在临床标本中检测了HBoVl、3的头．尾DNA序列和环状游离体结构，并在此基础上成功构建了HBoVl的感染性克隆，以绕开上述瓶颈进行致病机理的研究。鉴于腹泻病在我国儿童疾病谱中的重要地位，本研究对HBoV2进行了初步研究，以明确其与d,JL

7、腹泻病的可能相关性；得到了HBoV2包括头．尾序列在内的完整基因组，这是国际上的首次报道；并尝试构建HBoV2的感染性克隆，为阐明这一病毒的复制模式和致病机制打下基础。首先，为了了解北京地区急性腹泻患儿中HBoV2的流行情况并了解这一病毒的基因组特征，收集了2010年11月至2012年10月到首都儿科研究所附属儿童医院门诊就诊的急性腹泻患儿的粪便标本1068例，应用针对HBoV2NSl基因的PCR引物进行荧光实时PCR检测。选择2例病毒载量较高的阳性标本进行HBoV2各基因片段的扩增并测序。将所测

8、到的序列进行拼接后得到接近完整的HBoV2基因组序列并与GenBank中的相关序列进行比较分析。结果显示，所检测的2010年11月至2012年10月期间的1068例粪便标本中有24例HBoV2DNA检测阳性，阳性检出率为2．2％；各年龄组中，3～6月龄患儿中的HBoV2DNA阳性检出率最高，达3．6％(9／252)，其次为6--．9月龄(2．5％，5／203)的患儿，小于3月龄和大于3岁(含3岁)的患儿中未检测到HBoV2阳性标本；所检第一年度中，HBoV2阳性检出率在7月最高，为