重组人博卡病毒vp2病毒样颗粒免疫原性研究

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1、分类号学校代码10542密级学号—墅幽垒虹垒重组人博卡病毒VP2病毒样颗粒免疫原性研究ImmunogenicityofrecombinanthumanbocavirusVP2virus—·likeparticles研究生姓名指导教师姓名、职称学科专业研究方向湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一三年四月摘，要目的：人博卡病毒(HumanBocavirus，HB0v)的广泛传播已经严重影响到人类特别是儿童的生命健康。本课题旨在研究HBoVl和HBoV2的病毒蛋白2(viralprotein2,VP2)病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)的免疫原性，及免

2、疫途径和免疫佐剂对病毒样颗粒免疫原性的影响，探讨HBoVVP2VLPs作为疫苗的可能性。方法：通过重组杆状病毒感染草地夜蛾细胞(SpodopteraFrugiperda9，SF9)表达HBoVlVP2VLPs和HBoV2VP2VLPs，经氯化铯(CesiumChloride，CsCI)不连续密度梯度离心纯化获得高纯度HBoVlVP2VLPs和HBoV2VP2VLPs。分别于实验第0、3、6w用151．tgHBoVIVP2VLPs或HBoV2VP2VLPs加或者未加明矾佐剂，通过肌内注射(intramuscularinjection，IM)或皮内注射(intracutaneou

3、sinjection，m)途径免疫小鼠，实验第8w收集小鼠血清及脾脏淋巴组织。探索酶联免疫斑点试验(Enzyme．1inkedimmunospot，ELISPOT)检测HBoVVP2VLPs诱导特异性细胞免疫反应最佳实验条件，并检测HBoVVP2VLPs诱导的特异性细胞免疫反应强度；采用酶联免疫吸附试验(enzyme．1inkedimmunosorbentassay,ELISA)方法检测血清特异性IgG抗体效价，综合评价HBoVIVP2VLPs和HBoV2VP2VLPs的免疫原性。从细胞免疫反应强度、IgG抗体效价与IgC抗体活性三方面，分析免疫途径和免疫佐剂对其免疫原性的影

4、响，寻找最佳的免疫途径和免疫佐剂，并探讨HBoVl和HBoV2免疫血清的交叉反应。结果：1、多肽P3(GYIPIENEL)及P5(LYQ肝FFLL)为HBoVl特异性T细胞表位，P8(GYIPVIHEL)为HBoV2特异性T细胞表位；2、检测HBoVVP2VLPs诱导特异性细胞免疫反应的ELISPOT的最佳实验条件为：培养时间为24h，小鼠脾脏淋巴细胞浓度为5×105细胞／孔，特异性刺激多肽浓度为lOI．tg／ml：3、在特异性多肽的刺激下，HBoVl实验组特异性分泌IFN-),的细胞数为(1784-53)／106细胞，HBoV2实验组特异性分泌IFN-q,的细胞数为(156

5、+50)／106细胞，与对照组比较两者差异均有统计学意义(po．05)；5、HBoVlVP2VLPs和HBoV2VP2VLPs通过肌内注

6、射或皮内注射免疫诱导的特异性细胞免疫反应强度、血清IgG效价和IgG活性均无显著性差异(p>O．05)；6、明矾佐剂降低HBoVVP2VLPs诱导细胞免疫反应强度(正O．001)，增强HBoVVP2VLPs诱导的血清IgG效价(p<0．05)和IgC活性涉／o．01)。Ⅱ结论：1、成功获得高纯度HBoVlVP2VLPs和HBoV2VP2VLPs；2、首次获得2条HBoVl小鼠特异性T细胞表位多肽和1条HBoV2小鼠特异性T细胞表位多肽，并确定ELISPOT检测人博卡病毒VP2病毒样颗粒诱导特异性细胞免疫反应最佳实验条件；3、HBoVlVP2VLPs和HBoV2VP2VLPs能

7、诱导机体产生强烈的体液免疫反应和细胞免疫反应，具有很好的免疫原性，可用于疫苗的研究；4、肌内注射和皮内注射途径对HBoVVP2VLPs免疫原性无影响，肌内注射更便捷；5、明矾佐剂使HBoVVP2VLPs诱导的体液免疫反应增强，使HBoVVP2VLPs诱导的细胞免疫反应减弱。HBoVVP2VLPs作为预防性疫苗使用时应添加明矾佐剂，作为治疗性疫苗使用时应不加明矾佐剂。关键词：人博卡病毒(HBoV)，病毒蛋白2(VP2)，病毒样颗粒(VLPs)，免疫原性rnABSTRACTobjeetive：HumanBo