猪札幌病毒elisa检测方法及病毒样颗粒基因工程疫苗研究

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文猪札幌病毒ELISA检测方法及病毒样颗粒基因工程疫苗研究StudyonEnzyme-linkedImmunosorbentAssayforAntibodyandVirus-likeParticlesVaccineofPorcineSapovirus杨勃指导教师姓名马小军副教授（甘肃农业大学兰州730070）兰喜副研究员（中国农业科学院兰州兽医研究所兰州730046）学科专业名称临床兽医学研究方向动物免疫与抗病论文答辩日期2015年5月29日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席赵红斌研究员评阅人包世俊副教授景志忠研究员2

2、015年6月摘要札幌病毒(sapovirus，SaV)属于杯状病毒科（Caliciviridae）、札幌样病毒属（Sappora-likevirus），是单股正链的一种RNA病毒。可以引起人和动物的急性病毒性胃肠炎及腹泻，通常通过粪便和口腔交叉感染。猪札幌病毒(PorcineSapovirus，PoSaV)能够引起仔猪腹泻并广泛存在于世界范围内。近年来，SaV的研究内容相对较少，最新研究显示，SaV能够感染多种物种，不同基因型的SaV在遗传进化方面和抗原表位上有很多相似之处，并且已发现来自于人源和猪源重组的SaV毒株，说明SaV存在一定的跨种传播能力，严重时会对公共卫生安全构成潜

3、在的威胁。因此，研究较方便的ELISA诊断方法和免疫原性较好、安全性较高的预防性疫苗抗击病毒感染是一个紧迫的任务。VP1序列为猪SaV(PorcineSapovirus，PoSaV)的主要衣壳蛋白组成成分，可分为S区和P区。以SaV(CH430株)的RNA作为扩增模板得到目的基因并将其克隆到pET-30a载体中，并将成功构建的阳性质粒转入BL21（DE3）感受态细胞中诱导表达。纯化出PoSaV的VP1以及S区和P区蛋白，分别将S蛋白和P蛋白进行HRP标记，通过优化ELISA包被浓度和封闭时间，一抗二抗稀释度，封闭时间等条件成功建立了PoSaV双抗原夹心ELISA，为SaV的血清学

4、诊断提供了依据。同时将原核表达的VP1、P、S蛋白纯化后分别免疫了家兔和仔猪，制备了两种动物源的高免血清，为研究免疫原性和蛋白检测等提供了实验基础。VP1是PoSaVvirus-likeparticles(VLPs)组装的必需区，将PoSaVVP1编码蛋白TMTM的基因序列插入pFastBacHTB载体中，转入DH10BAC感受态细胞构成阳性重组杆粒；用重组阳性的杆粒转染sf9细胞得到重组杆状病毒，将其感染细胞至第三代杆状病毒，提取杆状病毒RNA和DNA，经PCR扩增鉴定外源基因没有丢失；采用TCID50方法确定重组病毒滴度；将重组病毒感染sf9细胞进行蛋白表达。表达的蛋白通过共

5、聚焦显微镜以及Western-blots试验证明外源基因成功在昆虫细胞内表达，相对分子质量为58-61kDa，与预测蛋白大小一致，并且为非分泌型蛋白，主要分布在细胞核周围以及细胞质中。蛋白经过浓缩处理后，进行蔗糖密度梯度离心纯化，通过电子显微镜观察VLPs大小和形态均模拟天然病毒结构。同时，将PoSaVVLPs免疫仔猪，通过建立的双抗原夹心ELISA方法检测抗体的生成并且稳定后，进行了攻毒试验，免疫组的仔猪可以有效地抑制病毒在肠道内I的复制，而对照组不能抑制病毒的复制。证明VLPs刺激机体产生的抗体能够阻止机体组织与病毒表面的抗原结合，阻止病毒黏附靶细胞受体，防止侵入细胞，从而起

6、到保护的作用。SaV-VLP疫苗对于猪SaV的防治具有良好的前景，可作为预防猪SaV的疫苗之一，本研究为PoSaV基因工程亚单位疫苗的研究奠定了基础。关键词：札幌病毒；衣壳蛋白；病毒样颗粒；酶联免疫吸附试验II甘肃农业大学硕士学位论文2015AbstractSapovirus（SaV）belongCaliciviridaeofSapporo-likevirusgenus,whichisasingle-strandRNAvirus.Humansandanimalscancauseacuteviralgastroenteritisanddiarrheabythefecal-oralt

7、ransmission.PorcineSapovirus(PoSaV)cancausePigletsdiarrheaandiswidespreadintheworld.Inrecentyears,fewstudiesresearchontheSaV.AnewstudyshowthatSaVcaninfectavarietyofanimals,forSaVdifferentgenotypesofhumanoriginandanimaloriginaresimilarinthegen