猪圆环病毒2型gem颗粒疫苗的初步研究

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1、猪圆环病毒2型GEM颗粒疫苗的初步研究GEMParticleVaccinesforPorcinecircovirustype2研究生：乔绪稳专业：预防兽医学导师：高崧教授侯继波研究员郑其升副研究员扬州大学兽医学院2013年5月乔绪稳：猪圆环病毒2型颗粒疫苗的初步研究猪圆环病毒2型GEM颗粒疫苗的初步研究研究生：乔绪稳LIYIII[112111[[14I[111[IIl911[11211[[171[IIH4I导师：高崧教授⋯侯继波研究员郑其升副研究员中文摘要PCV2是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原之一，造成宿主生长缓慢，免疫机能下降，易

2、与猪皮炎肾病综合症(PDNS)、猪呼吸系统疾病、猪支原体肺炎等一种或多种疾病共发，对我国养猪业造成巨大经济损失。国产PCV2传统灭活疫苗免疫效果不十分理想，主要原因是细胞增殖病毒滴度低和免疫抑制。因此，研制安全、高效、廉价的PCV2亚单位疫苗，替代进口同类产品，具有重要的现实意义。GEM(Grampositiveenhancermatrix)颗粒表面展示系统是近年发展起来的新技术，国外已有应用该技术研制新型人用疫苗的多篇报道。GEM是将乳酸菌经热酸处理、去除细菌原有蛋白质和核酸等大分子物质后获得的细胞壁肽聚糖骨架，具有特异性非共价结合细菌细胞壁水解酶C

3、端结构域(ProteinAnchor，PA)的特性。因此，与PA融合表达的目标抗原，可以高密度地展示在GEM颗粒表面。该系统用于研发新疫苗的独特优势包括：一是后期抗原纯化仅需低速离心即可，疫苗制备快速、价廉；二是GEM颗粒的主要成分肽聚糖本身具有免疫增强功能，可提高疫苗免疫效力；三是GEM颗粒源自食品级乳酸菌，与目标抗原结合、离心纯化后无核酸残留，因此无生物安全风险。本文应用GEM颗粒表面展示系统，成功研制出表面展示PCV2．Cap蛋白的GEM颗粒疫苗，并对其免疫原性进行了初步评价。实验表明，PCV2．Cap．PA融合蛋白产量高，GEM颗粒抗原免疫原性

4、好，为研$1JPCV2新型亚单位疫苗打下坚实的基础。1．GEM．PA系统基础构件的制备与鉴定GEM颗粒制备与鉴定。离心收集GMl7培养基新鲜培养的乳酸乳球菌(MGl363株)，菌体洗涤后用0．1mol／L的HCl重悬，煮沸30min，洗涤后计数。规2扬州大学硕士学位论文定2．5×109GEM颗粒为1U，将其浓度调整为10U／ml，．80。C保存备用。透射电子显微镜观察表明，GEM颗粒保持细菌原有骨架外形和大小，表面较为平滑，内部呈现均一的灰色，证明细菌原有蛋白质和核酸等大分子物质均已完全去除。锚钩蛋白PA制备与鉴定。以乳酸乳球菌(MGl363株)基因组

5、RNA为模板，利用RT-PCR方法，分别获得含有2、3+LySMs基序的基因片段，连入表达载体pET-32a(+)中，原核诱导表达，获得37kDa和29．4kDa两个蛋白质，均为包涵体形式表达，分别命名为PA2和PA3。GEM与PA特异性结合鉴定。lUGEM颗粒离心，分别用500烬复性后PA2和PA3蛋白重悬，室温孵育30min，离心收集沉淀。SDS．PAGE鉴定其结合效果。结果表明，PA2和PA3蛋白均能与GEM结合，但PA3与GEM颗粒结合活性明显要优于PA2。透射电子显微镜观察表明，GEM颗粒结合PA蛋白后，在其表面形成一层十分明显的絮状物。2．

6、PCV2．Cap蛋白颗粒抗原制备与鉴定融合蛋白的制备与鉴定。以PCV2(NJ株)DNA为模板，获得ORF2基因。分别构建PA与PCV2．CapN端和C端相连的两种融合基因的重组质粒pQZ-PA3-Cap和pQZ—Cap-PA3，利用大肠杆菌可溶性表达平台CVCll02对融合基因进行表达。SDS．PAGE鉴定表明，获得融合蛋白为44．6KD，Cap．PA3表达量要远低于PA3．Cap的表达量。其中，PA3．Cap约60．70％为可溶性表达。Western．blotting分析显示，两种融合蛋白与猪PCV2特异性抗血清呈阳性反应。融合蛋白与GEM颗粒结合特

7、性鉴定。取1UGEM颗粒各与2mlCap．PA3、PA3．Cap蛋白室温下结合，分别进行SDS．PAGE、电子显微镜观察及间接免疫荧光试验鉴定。结果表明，两种重组蛋白均可与GEM颗粒特异性结合，结合后的GEM颗粒表面形成一层较厚的PA．Cap蛋白层，该层蛋白可与PCV2特异性荧光抗体结合。此外，本章研究还建立了GEM．PA．Cap完全解离的SDS加热方法，用于PA3．Cap抗原定量分析。3．PCV2．Cap颗粒抗原免疫原性初步研究制备PA3．Cap融合蛋白，与GEM颗粒结合后，获得PCV2．GEM颗粒抗原，PA3-Cap含量为1mg／mL。按照100g

8、g／头的剂量，PCV2-GEM颗粒抗原分别不同的佐剂混合乳化，获得试验性疫苗，4。C保存备用。